细胞工程第五章细胞融合与单克隆抗体详解演示文稿

细胞工程第五章细胞融合与单克隆抗体详解演示文稿本文档共81页；当前第1页；编辑于星期日\22点26分1（优选）细胞工程第五章细胞融合与单克隆抗体本文档共81页；当前第2页；编辑于星期日\22点26分2细胞融合（cellfusion)，是指在离体条件下将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生！一、细胞融合本文档共81页；当前第3页；编辑于星期日\22点26分3Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。本文档共81页；当前第4页；编辑于星期日\22点26分4自发细胞融合（一）细胞膜融合

受精过程（二）体内细胞的自发融合

1、肌管的形成2、胚胎着床3、巨细胞和破骨细胞的形成4、肿瘤细胞的融合破骨细胞受精本文档共81页；当前第5页；编辑于星期日\22点26分5本文档共81页；当前第6页；编辑于星期日\22点26分6细胞融合的意义理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。本文档共81页；当前第7页；编辑于星期日\22点26分7二、人工诱导细胞融合

诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合化学融合剂诱导融合物理方法（电融合）

本文档共81页；当前第8页；编辑于星期日\22点26分8二、人工诱导细胞融合

（一）病毒诱导的细胞融合

有许多种类的病毒能介导细胞融合，如疱疹病毒、副粘液病毒、鸡新城疫病毒等。其中最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ）,为RNA病毒。

本文档共81页；当前第9页；编辑于星期日\22点26分9灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞（细胞膜具有一定的流动性）生物法：灭活的病毒（丧失感染性、保留抗原结构）本文档共81页；当前第10页；编辑于星期日\22点26分10(二)化学方法诱导细胞融合化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物（如甘油-醋酸酯、油酸、油胺等）、脂质体（如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸等）、钙离子、水溶性高分子化合物（如聚乙二醇）、水溶性蛋白质和多肽（如牛血清白蛋白、多聚L-赖氨酸等），其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。优点是易得，用法简单，融合效果稳定。本文档共81页；当前第11页；编辑于星期日\22点26分11（三）物理方法诱导细胞融合电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。本文档共81页；当前第12页；编辑于星期日\22点26分12电融合的基本过程：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。

电融合诱导法原理示意图本文档共81页；当前第13页；编辑于星期日\22点26分13三、杂种细胞的筛选根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型：异核细胞：非同源细胞的融合体。同核细胞：两个相同细胞的融合体。多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。本文档共81页；当前第14页；编辑于星期日\22点26分14基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选具有所需性状杂种细胞的筛选常用的杂种细胞筛选方法本文档共81页；当前第15页；编辑于星期日\22点26分15四、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体本文档共81页；当前第16页；编辑于星期日\22点26分16

免疫器官：免疫细胞生成、成熟或集中分布的场所，包括骨髓、胸腺、脾、淋巴结等

免疫细胞（发挥免疫作用的细胞）：1．吞噬细胞2．淋巴细胞（起源骨髓中的造血干细胞）T细胞（在胸腺中成熟）B细胞（在骨髓中成熟）

免疫活性物质：由免疫细胞或其他细胞产生的发挥免疫作用的物质，包括抗体、淋巴因子、溶菌酶等本文档共81页；当前第17页；编辑于星期日\22点26分17本文档共81页；当前第18页；编辑于星期日\22点26分18基本概念抗原抗体抗原决定簇（抗原表位）细胞克隆多克隆抗体单克隆抗体本文档共81页；当前第19页；编辑于星期日\22点26分19抗原（antigen，Ag），是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。抗原的基本性质具有异物性、大分子性和特异性。异物性是指进入机体组织内的抗原物质，必须与该机体组织细胞的成分不相同。大分子性是指构成抗原的物质通常是相对分子质量大于10000的大分子物质，分子量越大，抗原性越强。特异性是指一种抗原只能与相应的抗体或效应T细胞发生特异性结合。本文档共81页；当前第20页；编辑于星期日\22点26分20抗体（antibody,Ab)是机体免疫系统在抗原刺激下，由B细胞或记忆细胞增殖分裂成浆细胞所产生的可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。本文档共81页；当前第21页；编辑于星期日\22点26分21本文档共81页；当前第22页；编辑于星期日\22点26分22抗原决定簇（Antigenicdeterminant）是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope).抗原以抗原决定簇与相应淋巴细胞的抗原受体结合而激活淋巴细胞引起免疫应答。淋巴细胞表面的抗原识别受体通过识别抗原决定簇而区分“自身”与“异己”。抗原也是以抗原决定簇与相应抗体特异性结合而发生反应的。本文档共81页；当前第23页；编辑于星期日\22点26分23细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团本文档共81页；当前第24页；编辑于星期日\22点26分24本文档共81页；当前第25页；编辑于星期日\22点26分25多克隆抗体（Polyclonalantibody,PcAb）：针对多种抗原决定簇的混合抗体本文档共81页；当前第26页；编辑于星期日\22点26分26单克隆抗体（Monoclonalantibody,McAb）由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体本文档共81页；当前第27页；编辑于星期日\22点26分27

本文档共81页；当前第28页；编辑于星期日\22点26分281975年科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)将小鼠免疫细胞与肿瘤细胞融合，培养出既能迅速生长无限繁殖又可分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。从而获得针对某一特殊抗原决定簇的单克隆抗体。本文档共81页；当前第29页；编辑于星期日\22点26分29一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖杂种细胞动物细胞培养技术设计方案：动物细胞融合创始人：米尔斯坦单克隆抗体既能产生特异性抗体，又能大量繁殖本文档共81页；当前第30页；编辑于星期日\22点26分30

单克隆和多克隆抗体的比较和用途特异性敏感性均一性McAbPcAb低差无高强有1、用于免疫学检测，辅助临床诊断2、McAb用于亲和层析，分离微量可溶性抗原3、标记的McAb用于基础研究，了解细胞分化等4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。本文档共81页；当前第31页；编辑于星期日\22点26分31单克隆抗体在医学中的应用检验医学诊断试剂（1）病原微生物抗原抗体的检测（2）肿瘤抗原的检测（3）免疫细胞及其亚群的检测（4）激素测定（5）细胞因子的测定蛋白质的提纯肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术酶标仪本文档共81页；当前第32页；编辑于星期日\22点26分32动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂种细胞才能活动物细胞培养五、单克隆抗体制备过程获得产生相应抗体的B淋巴细胞筛选阳性杂交细胞HAT培养基单抗的纯化、检测本文档共81页；当前第33页；编辑于星期日\22点26分33动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂种细胞才能活动物细胞培养五、单克隆抗体制备过程获得产生相应抗体的B淋巴细胞筛选阳性杂交细胞HAT培养基单抗的纯化、检测本文档共81页；当前第34页；编辑于星期日\22点26分34B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有目的杂种细胞才能活HAT培养基本文档共81页；当前第35页；编辑于星期日\22点26分35HAT选择培养基HAT选择培养基组分

次黄嘌呤核苷酸（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A)（二氢叶酸还原酶抑制剂）胸腺嘧啶核苷酸（thymidine,T)本文档共81页；当前第36页；编辑于星期日\22点26分36细胞DNA合成途径1.主要途径：

氨基酸谷氨酰胺尿核苷单磷酸

叶酸及其衍生物（必不可少的媒介）2.补救途径：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）

胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）原料：次黄嘌呤核苷酸（H）、胸腺嘧啶核苷酸（T）本文档共81页；当前第37页；编辑于星期日\22点26分37B、B×B、B×瘤

—、瘤—×瘤—、瘤—只有目的杂种细胞才能活HAT培养基××××HGPRT—/TK—√本文档共81页；当前第38页；编辑于星期日\22点26分388-杂氮鸟嘌呤Br-脱氧嘧啶核苷HGPRT—TK—本文档共81页；当前第39页；编辑于星期日\22点26分39筛选阳性杂交细胞酶联免疫吸附测定ELISA本文档共81页；当前第40页；编辑于星期日\22点26分40本文档共81页；当前第41页；编辑于星期日\22点26分41免疫标记技术放射物标记技术酶标技术免疫荧光技术其他标记技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术双抗体夹心法竞争法双抗原夹心法间接法双位一点法本文档共81页；当前第42页；编辑于星期日\22点26分42本文档共81页；当前第43页；编辑于星期日\22点26分43ELISA原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关本文档共81页；当前第44页；编辑于星期日\22点26分44ELISA基本的实验过程包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色本文档共81页；当前第45页；编辑于星期日\22点26分45本文档共81页；当前第46页；编辑于星期日\22点26分46封闭本文档共81页；当前第47页；编辑于星期日\22点26分47本文档共81页；当前第48页；编辑于星期日\22点26分48本文档共81页；当前第49页；编辑于星期日\22点26分49本文档共81页；当前第50页；编辑于星期日\22点26分50本文档共81页；当前第51页；编辑于星期日\22点26分51本文档共81页；当前第52页；编辑于星期日\22点26分52本文档共81页；当前第53页；编辑于星期日\22点26分53本文档共81页；当前第54页；编辑于星期日\22点26分54本文档共81页；当前第55页；编辑于星期日\22点26分55动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂种细胞才能活动物细胞培养五、单克隆抗体制备过程获得产生相应抗体的B淋巴细胞筛选阳性杂交细胞HAT培养基单抗的纯化、检测本文档共81页；当前第56页；编辑于星期日\22点26分56本文档共81页；当前第57页；编辑于星期日\22点26分57本文档共81页；当前第58页；编辑于星期日\22点26分58本文档共81页；当前第59页；编辑于星期日\22点26分59本文档共81页；当前第60页；编辑于星期日\22点26分60本文档共81页；当前第61页；编辑于星期日\22点26分61本文档共81页；当前第62页；编辑于星期日\22点26分62本文档共81页；当前第63页；编辑于星期日\22点26分63视频：单克隆抗体的制备本文档共81页；当前第64页；编辑于星期日\22点26分64动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂种细胞才能活动物细胞培养五、单克隆抗体制备过程获得产生相应抗体的B淋巴细胞筛选阳性杂交细胞HAT培养基单抗的纯化、检测本文档共81页；当前第65页；编辑于星期日\22点26分65单抗纯化方法：盐析凝胶过滤离子交换层析亲和层析法本文档共81页；当前第66页；编辑于星期日\22点26分66用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。

血清50%饱和度硫酸胺

上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%饱和度硫酸胺上清沉淀拟球蛋白r球蛋白（1）盐析法本文档共81页；当前第67页；编辑于星期日\22点26分67（2）凝胶过滤法干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。交联葡聚糖凝胶(Sephadex)琼脂糖凝胶(Sepharose)本文档共81页；当前第68页；编辑于星期日\22点26分68（3）离子交换层析法DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂本文档共81页；当前第69页；编辑于星期日\22点26分69（4）亲和层析法将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）本文档共81页；当前第70页；编辑于星期日\22点26分70单克隆抗体特性理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备本文档共81页；当前第71页；编辑于星期日\22点26分71单抗鉴定方法：效价（凝集反应、Elisa、放免）特异性（免疫荧光、Elisa、间接血凝、免疫印迹）本文档共81页；当前第72页；编辑于星期日\22点26分72原