第十二讲 文库的构建

基因组文库和cDNA文库的构建

本文档共46页；当前第1页；编辑于星期六\12点36分第一节基因组文库的构建1基因组文库(genomielibrary):将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。

作用：获得特定基因。本文档共46页；当前第2页；编辑于星期六\12点36分2基因组文库的类型根据所选用的载体可以分为：质粒文库噬菌体文库黏粒文库人工染色体文库本文档共46页；当前第3页；编辑于星期六\12点36分3构建基因组文库应满足的条件3.1文库的完整性要包含基因组的完整序列信息，通过产生一系列一定大小、覆盖全基因组的DNA片段的重组克隆来实现。

本文档共46页；当前第4页；编辑于星期六\12点36分限制性内切酶……克隆、转化、培养、鉴定基因组DNA基因组文库本文档共46页；当前第5页；编辑于星期六\12点36分3.2基因组信息的可重建性通过建立叠连群(contig)重建完整序列信息。本文档共46页；当前第6页；编辑于星期六\12点36分3.3文库的大小即文库中应包含的独立重组子数。一般来说，DNA片段长，完整基因组文库所含的克隆数越少。反之，越多。基因组越大，文库应包含的克隆数越多，反之，越少。本文档共46页；当前第7页；编辑于星期六\12点36分4基因组文库的质量标准一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。本文档共46页；当前第8页；编辑于星期六\12点36分5基因组DNA文库构建的程序

(噬菌体基因组文库的构建)

⑴基因组DNA的分离制备不同来源的DNA制备方法不同。一般来说，有液相法和固相法两种。液相法提取的DNA长度一般在100kb左右，基本可以满足构建各种小插入片段基因组文库的要求。本文档共46页；当前第9页；编辑于星期六\12点36分大相对分子质量(highmolecularweight,HMW)基因组DNA的提取方法本文档共46页；当前第10页；编辑于星期六\12点36分本文档共46页；当前第11页；编辑于星期六\12点36分⑵基因组DNA的片段化①酶切部分酶切的主要目的是产生随机性的DNA片段用于构建基因组文库。②DNA分子的物理剪切DNA溶液的小孔喷射超声波处理高速搅拌

本文档共46页；当前第12页；编辑于星期六\12点36分⑶载体的制备要求：载体的去磷酸化处理载体的纯度

本文档共46页；当前第13页；编辑于星期六\12点36分⑷重组连接按照连接酶催化反应的最适条件设置反应体系，同时还应通过预备性实验确立反应体系具体的参数。本文档共46页；当前第14页；编辑于星期六\12点36分⑸噬菌体离体包装⑹重组噬菌体感染大肠杆菌

本文档共46页；当前第15页；编辑于星期六\12点36分6基因组文库的扩增筛选⑴文库的扩增基于噬菌体载体的基因组文库通过感染大肠杆菌，重组噬菌体在受体细胞中复制增殖并形成噬菌斑以实现增殖。

风险：在进行文库扩增时，很难保证重组分子均等增殖。所以造成有些克隆丢失，有的增加，有的减少。

本文档共46页；当前第16页；编辑于星期六\12点36分⑵文库的筛选噬菌斑原位杂交PCR文库筛选本文档共46页；当前第17页；编辑于星期六\12点36分基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装本文档共46页；当前第18页；编辑于星期六\12点36分第二节cDNA文库构建高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。本文档共46页；当前第19页；编辑于星期六\12点36分1概念cDNA文库：

将生物特定的组织器官或特定时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。本文档共46页；当前第20页；编辑于星期六\12点36分2cDNA文库优点

⑴cDNA克隆以mRNA为材料，特别适合某些病毒基因组结构研究及有关基因的克隆分离。⑵cDNA文库的筛选比较简单易行。⑶每一个cDNA克隆对应一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因序列。⑷可以在原核中表达。本文档共46页；当前第21页；编辑于星期六\12点36分3对cDNA文库质量评价3.1文库的代表性文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性。3.2重组cDNA片段的序列完整性。本文档共46页；当前第22页；编辑于星期六\12点36分4cDNA文库构建的步骤⑴分离mRNA；⑵富集mRNA；⑶cDNA的合成；⑷黏性末端片段与载体的连接；⑸离体包装获得重组噬菌体；⑹检测重组噬菌体效价。本文档共46页；当前第23页；编辑于星期六\12点36分cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA本文档共46页；当前第24页；编辑于星期六\12点36分本文档共46页；当前第25页；编辑于星期六\12点36分4.1细胞总RNA的提取和mRNA的分离RNA：tRNA、rRNA、mRNA(1%—5%）

真核生物的mRNA具有一个polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分离；

oligo(dT):polyA杂交链在高盐离子浓度下可以保持，在低盐离子浓度下或较高温度下就会分开，利用这一性质从RNA中分离纯化mRNA。

本文档共46页；当前第26页；编辑于星期六\12点36分本文档共46页；当前第27页；编辑于星期六\12点36分本文档共46页；当前第28页；编辑于星期六\12点36分4.2cDNA第一链的合成①

oligo(dT)引导的DNA合成法

利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。

本文档共46页；当前第29页；编辑于星期六\12点36分本文档共46页；当前第30页；编辑于星期六\12点36分②随机引物引导的cDNA合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis)根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。本文档共46页；当前第31页；编辑于星期六\12点36分4.3第二链cDNA的合成cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA:cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。cDNA第二链的合成的方法大致4种：自身引导合成法置换合成法引导合成法引物－衔接头合成法

本文档共46页；当前第32页；编辑于星期六\12点36分①自身引导合成法

获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶IKlenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。

本文档共46页；当前第33页；编辑于星期六\12点36分本文档共46页；当前第34页；编辑于星期六\12点36分②置换合成法

以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。本文档共46页；当前第35页；编辑于星期六\12点36分RNaseH：特异水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生带有3‘—OH和5’—P的产物本文档共46页；当前第36页；编辑于星期六\12点36分③引导合成法

本文档共46页；当前第37页；编辑于星期六\12点36分④引物-衔接头法本文档共46页；当前第38页；编辑于星期六\12点36分5全长cDNA文库(fulllengthcDNAlibrary)导致cDNA不完整的原因：

①cDNA第二链合成中聚合酶的外切核酸酶活性

②mRNA的降解，它容易从5‘端降解。起始生物材料、抽提和纯化过程中RNase的污染、机械断裂.

③反转录酶的合成特性

与mRNA的分子结构有关

与反转录酶从转录复合体上脱离有关

本文档共46页；当前第39页；编辑于星期六\12点36分oligo(dG)引导合成全长dscDNA

本文档共46页；当前第40页；编辑于星期六\12点36分载体引导合成全长dscDNA

本文档共46页；当前第41页；编辑于星期六\12点36分置换法合成全长dscDNA

本文档共46页；当前第42页；编辑于星期六\12点36分6基因组DNA文库与cDNA文库的比较cDNA文库只包含某种生物体特定组织、特定发育阶段表达的基因(具有时空特异性)。基因组文库的出发材料是完整的生物基因组DNA，每一个基因都存在于完全的基因组文库中，并不受生物组织或发育时期的影响。本文档共46页；当前第43页；编辑于星期六\12点36分

cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列，cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难；