高中生物-1.2基因工程的基本操作程序教学课件设计

☆选修3现代生物科技专题☆专题1基因工程学习目标：(1)了解基因工程中三种基本工具的作用及特点。(2)掌握基因工程原理及基本操作程序。(3)设计某一转基因生物的培育过程。基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平原理目的DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的生物类型和生物产品基因重组问题引领1、基因工程的定义2、基因工程的三种工具名称3、限制酶的来源、种类、作用、结果4、DNA连接酶的种类、作用5、质粒的特点、标记基因的作用6、载体必备的5个条件、种类一、基因工程的工具及其操作程序1．基因工程的基本工具作用作用部位限制酶DNA连接酶载体切割目的基因和载体连接DNA片段，形成重组DNA携带目的基因进入受体细胞核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二酯键限制酶DNA连接酶载体作用特点(条件)常用类型学.科.网zxxk.(1)识别特定的核苷酸序列(2)在特定位点上切割(1)E·coliDNA连接酶只连接黏性末端(2)T4DNA连接酶连接黏性末端和平末端(1)能在宿主细胞内稳定存在并大量复制(2)有多个限制酶切割位点(3)具有特殊的标记基因EcoRⅠ限制酶SmaⅠ限制酶E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶质粒、噬菌体、动植物病毒1.限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。2.DNA连接酶起作用时不需要模板。3.载体(1)作用①将目的基因转移到宿主细胞内。②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。(2)具备的条件①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。②有多个限制酶切割位点。③具有特殊的标记基因，以便进行筛选。2.基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取目的基因：人们需要的基因主要是指___________的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）用化学方法直接人工合成目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定编码蛋白质一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因1.基因组文库将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。2.部分基因文库受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核1.概念：PCR全称为_______________，是一项在________复制___________的核酸合成技术。4.前提：_______________________；5.条件：___________、___________、

_______________、______________。3.原理：___________6.方式：以_____形式扩增，即____（n为扩增循环的次数）2.结果：

多聚酶链式反应生物体外特定DNA片段DNA双链复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸引物热稳定DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板DNA（二）利用PCR技术扩增目的基因阅读教材P10-P11，回答以下问题：7.过程：高温变性（90~95℃）低温退火（55~60℃）适温延伸（70~75℃）多次重复变性、退火、延伸三步曲问题PCR技术与体内DNA复制有什么异同点？PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原料条件不同点解旋方式场所酶结果四种游离的脱氧核苷酸模板(DNA双链)、能量(ATP)、酶(DNA聚合酶)DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞内热稳定的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶大量的DNA片段或基因形成整个DNA分子（三）化学方法直接合成目的基因DNA合成仪蛋白质的氨基酸顺序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推测推测合成当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。（一）构建目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。（二）构建零件及其作用1.目的基因2.启动子本质：一段特殊结构的DNA片段位置：位于基因的首端功能：RNA聚合酶识别和结合的部位二、基因表达载体的构建（核心）3.终止子本质：一段特殊结构的DNA片段位置：位于基因的尾端作用：使转录在所需要的地方停止4.标记基因作用：鉴别和筛选含目的基因的受体细胞(三)基因表达载体的构建过程

(1)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，需要对某些天然的载体进行人工改造。(2)插入的目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位之前需有启动子，之后需有终止子。三、将目的基因导入受体细胞①转化：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。②受体细胞种类不同，导入方法不同。受体细胞种类方法植物细胞①农杆菌转化法：目的基因插入Ti质粒的T－DNA→转入农杆菌→导入植物细胞→稳定维持和表达②基因枪法（单子叶植物）③花粉管通道法（转基因抗虫棉）农杆菌转化法示意图：Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌受体细胞种类方法动物细胞显微注射法：目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→新性状动物微生物细胞Ca2＋处理受体细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子基因工程中受体细胞的选择基因工程的目的不同，选用的受体细胞不同。(1)培育转基因动物，受体细胞一般选用受精卵。(2)培育转基因植物，受体细胞可选用受精卵或体细胞，若选用体细胞，再通过植物组织培养，即可获得转基因植株。(3)若生产基因工程药品，受体细胞一般选用细菌，利用细菌繁殖速度快的特点，可在短期内获得大量产品。四、目的基因的检测与鉴定目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。常用的检测手段主要从

水平和

水平进行。分子生物学个体生物学类型步骤检测内容方法结果显示分子水平检测导入检测目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上表达检测目的基因是否转录出mRNA目的基因是否翻译出蛋白质DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)核酸分子杂交技术(DNA和mRNA之间)抗原--抗体杂交技术(抗原-抗体特异性结合)是否成功显示出杂交带同上同上个体生物学水平的鉴定①抗虫或抗病的接种实验②基因工程产品与天然产品活性的比较现代生物科技专题基因工程细胞工程胚胎工程基本工具操作程序生产应用载体DNA连接酶限制性核酸内切酶目的基因的检测与表达目的基因导入受体细胞基因表达载体的构建目的基因的获取蛋白质工程知识小结：归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞感受态细胞（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：是否表现出相应性状1．质粒作为“分子运输车”的条件是 (

)①能够自我复制②双链环状DNA分子③有多个限制酶切点④有标记基因⑤真核细胞中没有A．①②③④⑤ B．①②③④C．①③④ D．②③⑤【答案】

C巩固练习：２.下列关于DNA连接酶的叙述正确的是(

)①催化相同黏性末端的DNA片段之间的连接②催化不同黏性末端的DNA片段之间的连接③催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成④催化DNA分子两条链的脱氧核糖与磷酸之间磷酸二酯键的形成A．①③B．②④C．②③

D．①④

【答案】

D3．已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如下图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是 (

)A．3

B．4C．9 D．12【答案】

C3．下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是(

)A．需要限制酶和DNA连接酶B．必须在细胞内进行C．抗生素抗性基因可作为标记基因D．启动子位于目的基因的首端【答案】

B4．下列关于基因工程的叙述，错误的是

(

)A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达【答案】

D5．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSma

Ⅰ识别序列及切割位点G↓GATCCCCTAG↑GA↓AGCTTTTCGA↑AG↓AATTCCTTAA↑GCCC↓GGGGGG↑CCC(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是________________。(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止________。限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSma

Ⅰ识别序列及切割位点G↓GATCCCCTAG↑GA↓AGCTTTTCGA↑AG↓AATTCCTTAA↑GCCC↓GGGGGG↑CCC0,2高SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化

(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________________酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了________。限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSma

Ⅰ识别序列及切割位点G↓GATCCCCTAG↑GA↓AGCTTTTCGA↑AG↓AATTCCTTAA↑GCCC↓GGGGGG↑CCCDNA连接鉴别和筛选含有目的基因的细胞1.获取目的基因和切割载体时使用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。2.获取一个目的基因需限制酶切割两次，共产生4个黏性末端或平末端。3.限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性，以便于检测和筛选。学.科.网zxxk.6．科学家通过基因工程的方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如图所示，请分析回答：(1)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的T-DNA是利用T-DNA______________________________________

的特点。(2)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为________________。(3)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种,该题中涉及的是________________。(4)目的基因能否在棉株内稳定遗传的关键是__________________。可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上

转化农杆菌转化法目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上谢谢！【例2】转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶切割位点。请回答：(1)构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶_______________，对

进行切割。(2)培养基中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有______________，作为标记基因。PstⅠ、EcoRⅠ含抗病基因的DNA、质粒抗卡那霉素基因1.使用限制酶切割目的基因和质粒时，既要保证形成相同黏性末端，又要考虑保证目的基因和质粒中的标记基因的完整性。2.标记基因是鉴别受体细胞中是否含目的基因的依据。利用质粒作载体时往往利用其上的某抗性基因作标记基因，又可利用其抗性在适当的选择培养基上选择培养。二、基因工程的应用成果及蛋白质工程1．基因工程的应用成果(1)乳腺生物反应器与微生物生产的比较类型项目乳腺生物反应器微生物生产基因结构动物基因结构与人类基因结构相同与人类基因结构不同基因表达与天然蛋白质活性没有区别由于缺少内质网、高尔基体等细胞器，产物可能不具有生物活性产物提取从乳汁中较易分离提取从细胞中提取，较为复杂生产设备畜牧业生产，加工提取设备工业生产，设备精良 乳腺生物反应器受生物性别的限制，若从动物尿液中提取目的基因产物则不受性别限制。(2)基因治疗项目类型外源基因类型及举例过程特点成果举例体外基因治疗腺苷酸脱氨酶基因①从病人体内获得某种细胞②细胞培养③体外完成基因转移④筛选并扩增培养⑤重新输入患者体内操作复杂，但成功率高治疗复合型免疫缺陷症体内基因治疗治疗遗传性囊性纤维化病的基因外源基因―→载体携带体内相应组织细胞操作简单，成功率低治疗遗传性囊性纤维化病 基因治疗是治疗人类遗传病的根本方法，但由于尚未全面了解基因调控机制和疾病的分子机理，基因治疗只处于初期的临床试验阶段。2．蛋白质工程(1)概念：是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。(2)过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列。(3)蛋白质工程与基因工程比较项目蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品结果生产自然界没有的蛋白质一般是生产自然界已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现 蛋白质工程的实施步骤(蛋白质工程的实质即“中心法则”的逆推：3．继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：(1)将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是______________。(2)进行基因转移时，通常要将外源基因转入____________________中，原因是_____________________________________。显微注射技术受精卵(或早期胚胎)受精卵