PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测

阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测

李智伟PNH

(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria)

是一种罕见的获得性克隆造血干细胞疾病。但近年来有增多趋势。我国北方多于南方。半数以上发生在20-40岁青壮年。男性多于女性，与遗传及种族无关。本病起病隐袭缓慢，呈慢性过程，以贫血、出血为首发症状者较多，以血红蛋白尿起病者较少。血红蛋白尿

睡眠有关，早晨较重，下午较轻

尿液外观为酱油或红葡萄酒样;伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、发热等

原因因为补体作用最适宜的pH是6.8～7.O，而睡眠时呼吸中枢敏感性降低，酸性代谢产物积聚

研究历史Strubing第一次报道PNH

Ham和Dingle证明了PNH患者的红细胞在血清酸化条件下，易发生溶血，这就是现在普遍使用的Ham实验1983年证实PNH患者GPI合成异常1993年pig-a基因突变流式细胞术

原理：X染色体上PIG-A（造血干细胞经获得性体细胞基因）突变导致糖化肌醇磷脂(GPI)锚合成障碍

导致由GPI锚接在细胞膜上的一组膜蛋白丢失，包括CD16、CD55、CD59等GPI锚连接蛋白补体调接蛋白衰变加速因子(DAF或CD55)、膜攻击复合物抑制因子(MACIF或MIRL或CD59)、补体C8结合蛋白(HRF或C8bp)、膜辅助蛋白(MCP)。

粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3或CD58)、Blast-1/CD48、CD67、CD66。GPI锚连接蛋白酶类红细胞乙酰胆碱脂酶(AchE)、中性粒细胞碱性磷酶酸酶(NAP)、5’外核酸酶(CD73)。受体类中性粒细胞III型Fc受体(FcRIIIb或CD16)、单核细胞分化抗原(CD14)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(u-PAR)。血型抗原CD55携带的Comer抗原、AchE携带的Yt抗原。1型细胞CD59完全阳性补体激活途径C1C1C2,C4C4b2b(C3转化酶）C3C3bP（备解素）PC3bBbC3bB

(C5转化酶）C4b2b3b或PC3bBbC8C9C6C7C5C5bC5b678C5b-9(MAC)CD59替代途径经典途径CD55Ag-Ab分析1.红系及粒系FSC/SSC设门 报告标本中CD55、CD59阴性比例做20~30份正常人血样划定阳性区（Ⅰ区）范围同型阴性对照界定Ⅲ区范围，中间的区域即为Ⅱ区。根据CD59可以将PNH细胞分为3型1型细胞CD59完全阳性

正常细胞2型细胞CD59部分阳性

补体中度敏感细胞3型细胞CD59完全阴性

补体敏感细胞CD55和CD59同时部分或完全缺失是PNH的典型表现，单GPI缺失不能确诊。CD59重要性大于CD55单CD55缺乏时并不因此改变红细胞对补体的敏感性而造成溶血CD59的缺失会增加补体的敏感性临床上以CD59缺失作为诊断标准是一个趋势。解决了一切以补体溶血为基础的实验诊断方法在诊断PNH的不确定性意义其它细胞的PNH检测PNH患者的红细胞、粒细胞、单核细胞及淋巴细胞上GPI锚连膜蛋白部分或全部丧失。粒细胞>单核细胞>淋巴细胞>红细胞骨髓PNH克隆出现比外周血早，网织红细胞略早于红细胞其它细胞的PNH检测应用FSC/SSC设门分析时会有许多脱颗粒的中性粒细胞，这时只使用物理特征无法准确设定粒细胞门了，这时必须使用系列标志/SSC设门:CD15，CD33。CD64设门，分析单核CD14,CD55,CD59，PNH病人检测GPI缺乏的血小板不容易分辨不能只根据淋巴细胞上GPI相关蛋白的表达来诊断。

与其他实验比较

1.酸溶血试验(Ham试验)患者红细胞与含5%盐酸的正常同型血清混合，pH6.4，37℃孵育2小时，溶血明显。本试验特异性高，敏感性差。2.蛇毒因子溶血试验蛇毒因子能通过补体交替途径，使补体敏感的红细胞发生溶血。本试验特异性强，敏感性优于酸溶血试验。3.热溶血试验和蔗糖溶血试验

因特异性差，常作为筛选方法。具有PNH克隆的血液病

检测粒细胞GPI锚连蛋白表达

病种

检测例数

缺失例数(%)AA11525(22%)MDS399(23%)并发现MDS有PNH表达者ATG（人胸腺细胞免疫球蛋白）治疗有效

(AnInternMed1999，131:401)

PNH和AA关系相当密切，可以相互转化且并存AA→PNH较多(15%)，PNH→AA少20%`~30%PNH可伴骨髓再障AA(ATG治疗后)→PNH10~31%AA-PNH综合征16.5%(我国)50%AA外周血或骨髓可检出PNH克隆AA→PNH生存率要高于PNH→AAMDS-RA如捡出PNH克隆者预后好，且ATG(人胸腺细胞免疫球蛋白)治疗有效。PNH对AA和MDS的“自然治疗”，而“AA救了PNH”。PNH克隆见于淋巴增殖性疾病检测病种例数

NHL87HD55红细胞CD55/CD59CLL49缺失检出率9.2%ALL22HCL4

(HematolJ2001，2:33)

PNH克隆见于浆细胞病检测红细胞CD55/CD59缺失

病种检测例数缺失例数(%)MM626WM72MGUS61HCD21

合计7710(12.9%)

(IntJHematol2002,75:40)FLAER嗜水气单胞菌溶素变异体(FLAER)。1998年Diep等报道嗜水气单胞菌(HEC)毒素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合，随后立即聚合成多具体，插入细胞膜脂质双层，在膜上形成孔洞致溶破。PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持细胞完好。FLAERFLAER在所有具有GPI锚连蛋白的白细胞上都有特异性表达，所以正常人及非PNH贫血FLAER成100%阳性。是目前诊断PNH最敏感、特异的方法。FLAER对PNH克隆检出的敏感性为0.1%，其它靶向标记检出率的敏感性为1%；结果分析1.设门CD45/SSC2.标记CD15，CD14，CD45，FLAER 检测PNH粒、单核及淋巴细胞，报告标本中各系细胞FLAER阴性比例FLAER目前FLAER一般用于有核细胞的检测，不能评价红细胞的PNH克隆。由于红细胞表面没有气单胞菌溶素前体产生所需要的蛋白水解酶类，尽管表达在红细胞表面的血型糖蛋白不是锚连蛋白，但是由于血型糖蛋白与气单胞菌溶素前体结合力较弱，因此限制了FLAER在红细胞中的应用。与CD55、CD59比较，Flaer对PNH患者对中性粒细胞的测定最为清晰、准确临床上高度怀疑，而CD55、CD59不能确诊的病例，可以结合F1aer检查，获得明确诊断谢谢！胸腔穿刺适应证1.明确胸腔积液性质及病原学检测，以协助诊断与治疗。2.治疗用，积液量大产生压迫症状者，胸穿抽液可立即缓解症状，脓胸者行抽脓、清洗、注药。3.气胸的急症处理。胸腔穿刺禁忌症：局部皮肤感染出凝血障碍全身衰竭、休克胸腔穿刺---术前注意事项术前谈话（检查的意义及注意事项），家长签字；器械及药品准备：穿刺包及手套，培养基，1～2％普鲁卡因（需皮试）或2％利多卡因,消毒液;生命体征评估;胸片、B超或体检叩诊定位。

胸腔穿刺---术中注意事项穿刺点的选择

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根据胸片或B超选择叩诊实音且位置偏低部位为穿刺点。·大量积液时，穿刺点在腋后线第7-9肋间或腋中线第6-7肋间隙；·气胸穿刺点为锁骨中线外侧第2-3肋间隙；

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包裹性积液，需在X线透视或B超下定位。胸腔穿刺---术中注意事项麻醉：局部麻醉应充分、注意回抽。夹管：夹紧乳胶管避免气体进入胸腔。速度：抽吸液体时不可过快、过多，以免引起纵隔突然移动。每次总量：婴幼儿不超过150～200ml、年长儿不超过300～500ml,约20ml/kg。胸腔穿刺---术中注意事项胸膜反应：穿刺过程中患者出现头晕、面色苍白、出汗、心悸、气短时立即停止操作,吸氧、观察生命体征，必要时给予皮下注射0.1％肾上腺素0.3~0.5ml。穿刺过程中如有咳嗽、胸痛、面色转变或有严重出血即终止抽液，严密观察并对症处理。胸腔穿刺术后注意事项:

注意观察有无气胸等并发症,并作相应处理。胸腔穿刺---操作步骤体位：患儿取坐位，患侧手臂举过头；或反坐于靠背椅上，交叉两臂在椅背上，重病者可卧床，床头抬高，作侧胸穿刺。定位：术者站在患儿患侧，选择叩诊实音且位置偏低的部位，必要时用龙胆紫做记号。3.消毒：按常规用碘酒与酒精进行局部皮肤消毒。局麻：1%普鲁卡因或2％利多卡因局部麻醉皮内、皮下及肋间肌，按照进针、回抽（无回血）、注药，直至回抽有液体为止，无菌纱布压迫撤麻药针。胸腔穿刺---操作步骤5.穿刺：

1）左手食指将准备进针的肋骨上缘皮肤绷紧，

2）右手持尾部连有橡皮管的穿刺针，

3）先用止血钳夹紧橡皮管，在肋间隙下一肋骨的上缘垂直穿刺进针2-3cm，有阻力消失感表示已达胸腔。胸腔穿刺---操作步骤6.抽液：

1）将橡皮管尾端再接一50ml空针筒，放开止血钳缓缓抽吸液体。

2）抽满液体后先用止血钳夹住橡皮管再移去注射器，将液体送检或注入器皿中，如此反复抽吸计量。

3）穿刺完毕后，无菌纱布紧压针眼，在负压状态下连同注射器将针迅速拔出。

4）用消毒纱布盖住针孔，以胶布固定。胸腔穿刺---相关知识要点胸膜炎分类：干性、浆液纤维素性、化脓性。胸膜炎常见病因：

1）原发胸膜的疾病：肿瘤、创伤。

2）邻近组织的疾病：肺部感染、胸壁或横膈下感染、纵隔感染或肿瘤。

3）全身性疾病：败血症、恶性疾病、血管阻塞、结缔组织或胶原病、肉芽肿病。渗出液和漏出液的鉴别（见表）。

渗出液和漏出液的鉴别

漏出液渗出液外观清亮草黄色、稍浑浊比重<1.016~1.018>1.018细胞<100×106/L>500×106/L细胞分类以淋巴细胞与间皮细胞为主急性炎症，中性粒为主；结核性，淋巴为主蛋白<30g/L,以白蛋白为主>30g/L葡萄糖正常正常或降低

骨髓腔穿刺适应症：

1)血液病、神经母细胞瘤。

2)脂质代谢病、网状内皮细胞增生症。

3)骨髓培养。

4)某些寄生虫病的诊断。

5)紧急输液骨髓腔穿刺禁忌症严重出血患儿。局部皮肤感染。骨髓腔穿刺术前准备

1)术前谈话，家长签字。

2)骨髓穿刺包一个，普鲁卡因一支。2%碘酒，75%酒精，消毒棉签，无菌棉球，玻片数张。骨髓腔穿刺-髂后上棘穿刺适用于任何年龄的患儿。操作步骤：

1）患儿侧卧位，助手固定下肢及躯干。

2）术者站于同侧，常规消毒铺巾，穿刺点位于骶椎两侧、臀部上方突出部位,触摸为棱状边缘。

3）术者右手持针与骨面垂直，在穿刺点用普鲁卡因作皮内、皮下及骨膜局部麻醉。骨髓腔穿刺-髂后上棘穿刺操作步骤：

4）