Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究

Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究【摘要】为了研究velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡效应及机制，采用台盼蓝拒染法检测2、10、50和100nmol/Lvelcade处理U266细胞活率，用流式细胞术分析Annexin-V、线粒体跨膜电位(Δψm)和氧自由基，用半定量RT-PCR法检测bcl-2mRNA的表达。结果表明：velcade抑制U266细胞增殖；诱导U266细胞凋亡，24小时Annexin-V阳性细胞比例增高，△ψM降低；12小时时活性氧明显增高，荧光强度增强；抗凋亡基因bcl-2表达降低。结论：velcade对U266细胞具有增殖抑制和杀伤作用，其可通过内源性细胞凋亡信号通路诱导U266细胞凋亡。

【关键词】velcade;多发性骨髓瘤;细胞凋亡

MultipleMyelomaCellLineU266ApoptosisInducedbyVelcade

AbstractToinvestigatetheeffectofvelcadeonmultiplemyelomacelllineU266apoptosisanditsmechanism，cellviabilitywasestimatedbytrypanbluedyeexclusion.Annexin-V，mitochondrialtransmembranepotential(Δψm)andreactiveoxygenspecies(ROS)labeledbyDCFHDAwereexaminedbyflowcytometry，theexpressionofbcl-2mRNAwasdetectedbysemi-quatitativeRT-PCR.TheresultsshowedthatthevelcadeinhibitedthegrowthofU266cellsandreducedcellviabilityaccompaniedbyappearanceofmorphologiccharacteristicsofapoptosis.Velcadeat50nmol/LincreasedAnnexinVpositivityandfluorescenceintensityofDCFbecauseofROSgenerationwhileitdecreasedtheΔψmofU266cells.Expressionofanti-apoptoticgenebcl-2mRNAalsodecreased.ItisconcludedthatvelcadeinhibitethegrowthandreducecellviabilityofU266cells.VelcadecaninduceU266cellsapoptosisbyintrinsiccellapoptoticpathway.

Keywordsvelcade;multiplemyeloma;apoptosis

多发性骨髓瘤是一种浆细胞克隆性增生的血液系统恶性肿瘤，多发生于老年人。随着社会人口的老龄化，其发病率呈逐渐增高的趋势。几十年来对MM一直采用激素和细胞毒性药物联合治疗，尽管近年来加用反应停抑制血管新生治疗或采用自体骨髓移植治疗，但其仍是一种不可治愈的血液系统肿瘤。由此可见，开发新的治疗方法有重要的临床价值。蛋白酶体抑制剂近年来作为MM新的治疗制剂用于临床试验，本研究就临床新药蛋白酶体抑制剂velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞的凋亡作用进行探讨。

材料和方法

细胞培养

U266细胞置于含10%的热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2和95%空气湿度条件下进行培养。实验过程中，细胞以×105细胞/毫升的密度接种培养，并与不同浓度velcade一起进行孵育，对照加DMSO。细胞活率由台盼蓝拒染法检测，根据处理组存活细胞数与死细胞数的比例来计算。形态学观察，细胞用cytospin(Shandon，Runcorn，UK)收集至载玻片，用瑞氏染液染色并置于光学显微镜下观察。每次试验重复3次。生长抑制率及细胞活率按如下公式计算

生长抑制率＝［(对照组细胞数-处理组细胞数)／对照组细胞数］×100%存活率＝［活细胞数／(活细胞数＋死细胞数)］×100%

Annexin-V、线粒体跨膜电位(Δψm)和氧自由基的流式细胞仪分析

Annexin-V分析

使用FITC标记的AnnexinV和PI双染法检测细胞凋亡，根据BectonDickinsonBiosciences公司提供的说明书进行操作。简单地说，取×105细胞，经PBS漂洗后加100μl结合缓冲液，重悬细胞，加5μlAnnexinV-FITC，10μlPI避光孵育15分钟后加400μl结合缓冲液，用流式细胞仪检测。

线粒体跨膜电位(Δψm)检测

取5×105细胞，用PBS清洗1次，加入10μg/mlRh12337℃孵育30分钟，用PBS漂洗1次，加入终浓度10μg/mlPI4℃暗处放置30分钟，用流式细胞仪检测。

活性氧测定细胞内活性氧测定方法参照文献［1］方法进行，DCFHDA(Sigma公司产品)自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比。DCF的激发波长为485nm，吸收波长为530nm。将药物处理的细胞经过PBS洗涤，重悬于1ml含有10μmol/LDCFHDA的PBS中，以未加染料的样品作为对照，37℃孵育20分钟，以PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测5000个活细胞的荧光强度。

velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266bcl-2mRNA表达的半定量RT-PCR检测

细胞总RNA抽提收集3×106细胞，用TRIzoL试剂按说明书抽提细胞总RNA。

cDNA合成及PCR扩增方法参见文献［2］，PCR引物：GAPDH：有义链5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′；反义链5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。bcl-2:有义链5′-ACTTGTGGCCCAGATAGG-3′，反义链为5′-CGACTTCGCCGAGATGTC-3′。PCR产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析照相，在双波长色谱扫描仪上扫描电泳带。GAPDH片段长度216bp，bcl-2片段389bp。

结果

velcade对U266细胞增殖抑制和杀伤作用

研究结果表明，velcade可以抑制U266细胞的生长，同时伴有细胞活率的降低。U266细胞经2、10、50和100nmol/L浓度velcade24小时处理后生长抑制率的3次均值分别为％、％、％和％，48小时时分别为％、%、％和％；在0、2、10、50和100nmol/L浓度时24小时活率分别为％、％、％、％和％，48小时时分别为％、％、％、％和%。根据活率48小时时下降70％-80％选择药物浓度，因此选择velcade50nmol/L作为药物处理浓度。

velcade对U266细胞凋亡作用

50nmol/Lvelcade处理的U266细胞呈现出细胞形态学改变，表现为染色体凝聚、细胞核破裂而细胞膜保持完整及出现多个凋亡小体等。24小时AnnexinV-FITC/PI双标结果显示，凋亡细胞比例重复3次的均值为％，明显高于未用velcade处理对照组的%。线粒体跨膜电位检测显示△ψM降低，Rh123阳性细胞比率重复3次的均值为%，对照为%。

活性氧检测

我们采用DCFHDA检测velcade处理的U266细胞活性氧及平均荧光强度。结果发现，在12小时时活性氧明显增高，平均荧光强度显着增高，由对照的增强到，流式细胞仪直方图右移。

bcl-2检测

采用RT-PCR检测内源性细胞凋亡通路最主要的基因bcl-2。结果显示，U266细胞经50nmol/Lvelcade处理后，随着作用时间的延长，其表达逐渐降低。

讨论

泛素-蛋白酶体通路是由泛素化系统和蛋白酶体组成，在调节细胞周期和肿瘤生长中有着重要的作用，该通路参与细胞内绝大多数的蛋白降解，如许多重要的涉及细胞信号转导、转录调控和细胞周期的调节蛋白。蛋白酶体存在于所有的真核细胞中，蛋白酶体抑制剂可以通过干涉这些重要蛋白的降解，触发肿瘤细胞周期阻滞，诱导肿瘤细胞凋亡而使肿瘤进展延缓或静止［3-7］。

Velcade是一种硼酸二肽化合物，是高选择性、可逆性的26S蛋白酶体抑制剂，首先在美国国家肿瘤协会的一组60种肿瘤细胞系中表现出抗肿瘤作用。velcade对MM细胞的作用表现在诱导细胞凋亡、抑制生长、抑制细胞黏附和骨髓血管生成等多个方面。本研究显示，其对U266细胞具有增殖抑制作用，并随着时间的延长和剂量的增加呈现增殖抑制加强，活率降低趋势。

诱导细胞凋亡有3种信号通路：FAS信号通路、线粒体信号通路和内质网信号通路，目前认为线粒体途径在凋亡过程发挥枢纽作用。细胞凋亡过程中，细胞膜双分子层中的磷脂不平衡分布会被破坏，发生磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)由内层向外层的翻转，暴露在外面的磷脂酰丝氨酸可被周围的吞噬细胞识别、吞噬，从而使凋亡细胞得以被清除。

AnnexinV为一种磷脂结合蛋白，可特异性地识别细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸，所以经常被用于检测细胞凋亡［8］。Rh123是一种亲脂性阳离子，可发射绿色荧光，它可被线粒体吸收，并且其吸收量与线粒体△ψm成正比［9］。正常的活细胞因为线粒体△ψm高，所以其摄入的Rh123也高，因此细胞会发出绿色荧光。而细胞发生凋亡时线粒体△ψm会降低，细胞表现为Rh123低染。本研究结果显示，Velcade处理U266细胞24小时时凋亡细胞明显增高，△ψm明显降低，这说明细胞大部分是通过诱导细胞凋亡而死亡的，Velcade还可通过线粒体信号通路，即内源性凋亡途径诱导U266细胞凋亡。

ROS是细胞有氧呼吸过程中产生的一些小分子物质，主要包括O-2、OH-及其活性衍生物如H2O2、HOCl、O2等。这些物质具有较高的反应活性，易与细胞内的大分子物质反应，导致细胞结构的广泛损伤，如膜脂质过氧化、蛋白质及核酸等的氧化损伤等。近年的研究认为，活性氧是细胞凋亡的信号之一，ROS的产生可直接或间接改变线粒体膜电位，促进CytC从线粒体内释放，启动线粒体信号通路，诱导细胞凋亡［10］。线粒体是ROS产生的主要场所，内质网中同样会有ROS的生成。Fribley等报道［11］蛋白酶体抑制剂velcade通过同时诱导ER应激和ROS生成引起人头颈癌细胞凋亡，ROS的抑制剂Tiron能够显着抑制凋亡，caspase-9和caspase-3的活化，并且能够阻碍ER应激相关蛋白ATF-4和CHOP/GADD153的表达。这些结果提示，ROS在ER应激诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。用DCFHDA作为荧光探针测定细胞内ROS水平时，发现velcade在24小时时能明显增高U266细胞内活性氧水平，这说明velcade可改变多发性骨髓瘤细胞内氧化还原状态，导致线粒体和内质网产生ROS增多，从而诱导U266细胞凋亡。由此我们推测，不仅线粒体途径参与了velcade诱导的多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡，而且ER应激途径也可能通过ROS的产生而发挥诱导凋亡作用。

bcl-2基因是抗细胞凋亡的关键基因，其表达的增高与多种肿瘤有着密切关系，并且可导致肿瘤细胞抵抗糖皮质激素、柔红霉素、阿糖胞苷及VP16等化疗药物诱导的凋亡，使肿瘤细胞对各种化疗药物耐受，导致缓解率低［12］。bcl-2表达降低在内源性细胞凋亡即线粒体信号通路中起关键作用，很多化疗药物可通过抑制bcl-2基因表达从而诱导肿瘤细胞凋亡。本研究通过半定量RT-PCR的方法检测了bcl-2mRNA的表达，结果显示其表达水平降低，并随着velcade药物作用时间的延长而表达量逐渐减少，这一结果从分子水平进一步证实了velcade的诱导细胞凋亡作用及其作用机制主要是通过线粒体信号通路。

【参考文献】

1ShenHM，ShiCY，ShenY，etal.DetectionofelevatedreactiveoxygenspecieslevelinculturedrathepatocytestreatedwithaflatoxinB1.FreeRadicBiolMed，1996；21:139-146

2ChenGQ，ZhuJ，ShiXG，etal.Invitrostudiesoncellularandmolecularmechanismsofarsenictrioxide(As2O3)inthetreatmentofacutepromyelocyticleukemia:As2O3inducesNB4cellapotosisiswithdownregulationofBCL2expressionandmodulationofPML-RARα/PMLproteins.Blood，1996；88:1052-1061

3AdamsJ，PalombellaVJ，ElliottPJ.Proteasomeinhibition:anewstrategyincancertreatment.InvestNewDrugs，2000；18:109-121

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7AdamsJ，PalombellaVJ，SausvilleEA，etal.Proteasomeinhibitors:anovelclassofpotentandeffectiveantitumoragents.CancerRes，1999；59:2615-2622

8OverbeekeR，Steffens-NakkenH，VermesI，etal.Earlyfeaturesofapoptosisdetectedbyfourdifferentflowcytometryassays.