抗原和抗体的制备

抗原和抗体的制备第一页，共六十一页，编辑于2023年，星期日第一节抗原的准备天然抗原的制备人工抗原的制备合成抗原第二页，共六十一页，编辑于2023年，星期日抗原制备的主要技术途径天然抗原——分离、纯化半抗原——人工合成、载体联接抗原肽——合成、基因工程制备第三页，共六十一页，编辑于2023年，星期日天然抗原的制备颗粒抗原的制备可溶性抗原蛋白抗原多糖抗原

第四页，共六十一页，编辑于2023年，星期日颗粒抗原的制备1、血红细胞抗原的制备：动物的新鲜血液+抗凝剂

离心去上清

NS悬浮

离心洗涤三次（2000转/分）

第五页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

绵羊红细胞的制备流程图4℃可保存3周取适量NS洗涤3次2000r/min10minNS稀释至2～5%摇动15-20min第六页，共六十一页，编辑于2023年，星期日颗粒抗原的制备2、细菌抗原的制备细菌培养（37℃，24小时）杀菌（100℃，2小时）

NS稀释

菌体抗原第七页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或斜面培养37℃24h100℃水浴2～2.5h杀菌无活菌试验NS稀释成8～10亿/mlO菌体抗原第八页，共六十一页，编辑于2023年，星期日种类：蛋白质多糖和细菌毒素。细胞内存在的部位：胞外抗原和胞内抗原。胞外抗原:收集培养液或分泌物。胞内抗原:提取、分离和纯化。可溶性抗原的分离纯化第九页，共六十一页，编辑于2023年，星期日胞内抗原的提取、分离和纯化细胞的破碎分离纯化第十页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

1.酶处理法2.冻融法3.超声破碎法4.表面活性剂处理细胞的破碎第十一页，共六十一页，编辑于2023年，星期日1、酶处理法常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等

特点：①适用于多种微生物；②作用条件温和；③内含物成分不易受到破坏；④细胞壁损坏的程度可以控制。第十二页，共六十一页，编辑于2023年，星期日2、冻融法原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。特点：适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。第十三页，共六十一页，编辑于2023年，星期日3、超声破碎法原理：①利用超声波的机械振动而使细胞破碎。②超声波使用的频率从1kHz～20kHz，③间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。特点：①操作简单，重复性较好，节省时间；②多用于微生物和组织细胞的破碎。第十四页，共六十一页，编辑于2023年，星期日4、表面活性剂处理法原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。应用：破碎细菌，且作用比较温和。第十五页，共六十一页，编辑于2023年，星期日抗原的纯化1.超速离心法2.选择性沉淀法3.凝胶层析法4.离子交换层析法5.亲合层析法第十六页，共六十一页，编辑于2023年，星期日1、超速离心法原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分离，如IgM、载脂蛋白A、B等。第十七页，共六十一页，编辑于2023年，星期日2、选择性沉淀法原理：根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解度不同），常用33～50％饱和度的硫酸胺。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。第十八页，共六十一页，编辑于2023年，星期日3、凝胶层析法原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，由于分子大小的不同先后被洗脱出来，从而实现对不同分子大小的物质进行分离。常用的如：如葡聚糖凝胶填料（sephadex柱）第十九页，共六十一页，编辑于2023年，星期日凝胶层析（分子筛）第二十页，共六十一页，编辑于2023年，星期日4、离子交换层析法原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使血清中的蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。第二十一页，共六十一页，编辑于2023年，星期日离子交换层析+++———————++++++++——+++——++第二十二页，共六十一页，编辑于2023年，星期日5、亲和层析法原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。第二十三页，共六十一页，编辑于2023年，星期日正常细胞＋标记细胞洗滴标记细胞被酶裂解加入特异性抗体其它蛋白洗涤流失SDS分离蛋白

亲和层析法示意图第二十四页，共六十一页，编辑于2023年，星期日亲和层析第二十五页，共六十一页，编辑于2023年，星期日抗原的鉴定1.含量鉴定：凯氏定氮法

2.理化性质鉴定①凝胶层析技术测定②聚丙烯酰胺凝胶电泳③凝胶管状电泳④超速离心3.纯度鉴定

常用醋酸纤维膜电泳

4.免疫活性鉴定

常用双向琼脂扩散试验第二十六页，共六十一页，编辑于2023年，星期日半抗原免疫原的制备

1.半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。2.载体：蛋白质类多肽聚合物大分子聚合物3.半抗原-载体连接方法第二十七页，共六十一页，编辑于2023年，星期日半抗原

+载体抗体BT完全抗原BBBT第二十八页，共六十一页，编辑于2023年，星期日载体类型1.蛋白质：

人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。2.多肽聚合物：

人工合成的，常见的有多聚赖氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)，这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动物产生高效价、高亲和力的抗体。3.大聚合物：

羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦可诱发动物产生抗体。第二十九页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

半抗原-载体连接方法1碳化二亚胺法：R-NH=CH-R’半抗原＋载体蛋白质搅拌1～2h室温24h透析除去未反应的半抗原人工免疫原半抗原载体连接方法1混合第三十页，共六十一页，编辑于2023年，星期日混合戊二醛法:半抗原-NH2载体蛋白-NH2半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-载体蛋白OHC-(CH2)3-CHO*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双功能联接剂半抗原载体连接方法2第三十一页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

半抗原-载体连接方法3氯甲酸异丁脂法：半抗原-COOH载体蛋白-NH2Cl-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-CO-NH-载体蛋白半抗原载体连接方法3简便，用于类固醇抗原制备HO-CH2CH(CH3)2＋第三十二页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

半抗原-载体连接方法4琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备半抗原-CH2OHCH2-COCH2-CO带羧基的半抗原琥珀酸衍生物半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH吡啶再经氯甲酸异丁脂法或碳化二亚胺法制备载体半抗原半抗原载体连接方法4第三十三页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

佐剂

概念：

能非特异地通过物理或化学方法与抗原结合从而增强其特异性免疫原性的物质。条件：①增加抗原的表面积；②改变抗原的活性基团构型；③佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间；④可直接或间接激活免疫活性细胞；⑤无毒性或无副作用。第三十四页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

（二）常用佐剂的种类和制备1.氢氧化铝佐剂：5%硫酸铝5%氢氧化钠氢氧化铝沉淀制成悬液即为佐剂强烈搅拌NS洗二次NS等体积抗原免疫接种常用佐剂的种类及制备第三十五页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

2.明矾佐剂10%硫酸钾铝氢氧化钠校正pH值至6.5沉淀乳状悬液*明矾佐剂抗原常用于肌肉注射，皮下注射易引起肉芽种和脓肿。NS搅拌NS洗二次离心抗原备用防腐剂第三十六页，共六十一页，编辑于2023年，星期日作用大于不完全佐剂局部形成肉芽种和溃疡不能用于人体弗氏完全佐剂

3.弗氏佐剂(Freundadjuvant)液体石蜡完全乳化备用＋高压灭菌加热抗原弗氏不完全佐剂卡介苗羊毛脂鉴定一滴乳剂乳剂不散浮于液面水中混合第三十七页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

①增强抗原对机体的免疫原性；②增强抗体的产生能力；③为制备出高效价的免疫血清；⑤在某种情况下，改变Ag免疫应答类型；⑥延长抗原在免疫动物的时间；⑧增强局部对变应原的超敏反情况。佐剂的作用第三十八页，共六十一页，编辑于2023年，星期日人工抗原及基因工程抗原用化学合成法或基因重组法制备含有已知化学结构决定簇的抗原，称之为人工抗原。它可包括人工结合抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。第三十九页，共六十一页，编辑于2023年，星期日人工合成抗原用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽。应用这种人工合成多肽可作为抗原。只由一种氨基酸形成的聚合体称为同聚多肽，如由左旋赖氨酸形成的同聚多肽。由二种或二种以上氨基酸形成的聚合多肽称为共聚多肽，如由酪氨酸、谷氨酸与多聚丙氨酸和赖氨酸组成的聚合成多肽。第四十页，共六十一页，编辑于2023年，星期日基因工程抗原将编码免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并与适当载体DNA分子相结合，然后引入受体细胞中使之表达，即能获得免疫原性之融合蛋白，经纯化后即基因工程疫苗。基因工程乙型肝炎病毒疫苗和在牛痘苗表达系统中研制乙肝病毒的重组感染载体的多价疫苗。第四十一页，共六十一页，编辑于2023年，星期日小结抗原的种类颗粒性抗原的制备可溶性抗原提取分离纯化方法抗原的鉴定半抗原免疫原的制备佐剂的作用第四十二页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

第二节抗体的制备多克隆抗体的制备单克隆抗体技术基因工程抗体第四十三页，共六十一页，编辑于2023年，星期日多克隆抗体的制备1.免疫动物选择2.免疫方法3.动物采血法4.免疫血清的分离及保存

第四十四页，共六十一页，编辑于2023年，星期日免疫动物的选择能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。免疫动物的选择原则：1.抗原与免疫动物种属差异越远越好；2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、体重合乎要求；3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答；4.按需要量选择大小不同的动物。第四十五页，共六十一页，编辑于2023年，星期日免疫方法1.免疫原的注射剂量2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮内＞淋巴结＞足掌3.免疫方案①全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射

②微量免疫法：卡介苗弗氏佐剂抗原③混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉7天1月第四十六页，共六十一页，编辑于2023年，星期日1.颈动脉放血法2.心脏采血法3.静脉采血法动物采血法第四十七页，共六十一页，编辑于2023年，星期日免疫血清的分离和保存免疫血清的分离1、室温自然凝固，然后放置37℃或4℃待凝块收缩，分离血清。2、抗血清分出后要经56℃30min灭活。免疫血清的保存1.4℃保存：可保存3～6个月2.低温保存：-20～-40℃，可保存2～3年3.冰冻干燥保存：可保存3～5年第四十八页，共六十一页，编辑于2023年，星期日特异性抗体的纯化1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异性抗体。2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。第四十九页，共六十一页，编辑于2023年，星期日特异性IgG抗体的纯化1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐析提取γ球蛋白3次，基本为IgG类抗体，但不纯。2.A蛋白亲和层析：SPA与IgG的Fc段有很强的特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地与抗体结合，一个A蛋白至少可以结合二个IgG分子。适合纯化细胞培养上清中的McAb。3.其它：凝胶过滤、离子交换层析等第五十页，共六十一页，编辑于2023年，星期日特异性抗体的鉴定1.抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定2.抗体特异性鉴定

①细菌类抗原的抗体用凝集试验②可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验3.抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法4.抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好第五十一页，共六十一页，编辑于2023年，星期日亲合力亲合力是指抗体与结合抗原的活度或牢固度。抗体与抗原结合疏松，结合后会迅速解离，称为亲合力低，反之，亲合力高。亲合力的高低是由抗原分子的大小，抗体分子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。亲合力常以亲合常数K表示。K的单位是升/摩尔（L/mol）。在RIA中，K是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的倒数，K=1/[H]，[H]是最小检出量，通常，K的范围在108～1012L/mol之间。第五十二页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

单克隆抗体技术单克隆抗体：由B细胞杂交瘤产生的只识别抗原分子上一种抗原决定簇的抗体分子。第五十三页，共六十一页，编辑于2023年，星期日

杂交瘤技术的原理及流程第五十四页，共六十一页，编辑于2023年，星期日HAT培养基是含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全培养基。在氨基蝶呤(二氢叶酸类似物)存在下，这种酶缺陷的细胞不能通过核苷酸合成旁路合成次黄嘌呤和胸苷。制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。PEG：聚乙二醇

第五十五页，共六十一页，编辑于2023年，星期日单克隆抗体的特性

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