CD123在急性早幼粒细胞白血病微小残留病检测中的应用

CD123在急性早幼粒细胞白血病微小残留病检测中的应用

作者：王亚哲，常艳，主鸿鹄，秦亚溱，李金兰，付家瑜，李玲娣，陈珊珊，黄晓军，陆道培，刘艳荣

【摘要】为了探讨CD123联合应用其它免疫标志检测急性早幼粒细胞白血病(APL)中微小残留病(MRD)的作用及意义，采用四色流式细胞术(FCM)分析了186例初诊APL患者的免疫表型特点及20例正常骨髓中与APL细胞表型相同的细胞所占比例，并应用以CD34/CD117/CD123/HLA-DR为主的4色抗体组合对172份标本进行MRD检测并与实时定量PCR结果相比较。172份标本包括19例连续随访APL患者的116份骨髓或外周血标本和47例距初诊3个月至2年不等的非连续随访患者的56份骨髓标本，其中形态学完全缓解(CR)后117份，CR前55份标本。对18份标本同时加做抗体组合CD9/CD117/CD34/CD33检测。结果表明：初诊APL患者除高表达CD9、CD33、CD117和低表达CD34、HLA-DR外，CD123的阳性表达率为100%(30/30)；正常骨髓中CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞和CD117+CD34-CD9+CD33+细胞在有核细胞中的比例分别为%和%，与APL患者相比相差4个对数级；随访期内，19例患者全部获得形态学CR，中位时间为4周(3-6周)，13例FCM结果转阴的中位时间为周(5-11周)，11例PCR结果转阴的中位时间为8周(5-12周)；形态学CR后随访的117份标本中41份FCM检测MRD呈阳性，8份标本CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞比例5%，中位值为%(%-%)，33份标本CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞比例5%，中位值为%(%-%)；CD117+CD34-细胞中CD123+HLA-DR-细胞的中位相对比例分别为%(%-%)和%(%-%)；FCM与PCR同时检测MRD结果显示，FCM(+)标本中%(93/97)PCR为阳性，FCM的假阳性率为%(4/97)，PCR的假阴性率为%(7/93)。FCMMRD(-)标本中，92%(69/75)PCR阴性，8%(6/75)为PCR阳性。连续随访的116份标本和形态学CR后的117份标本显示，CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞比例与实时定量PCR检测的mRNA水平基本一致，两者均有一定的相关性(r=，和r=，)。结论：应用CD34/CD117/CD123/HLA-DR为主的2组4色抗体组合检测APL患者中的MRD简单可行，可与PCR检测相互补充。

【关键词】急性早幼粒细胞白血病

ApplicationofCD123inDetectionofMinimalResidualDiseasein

AcutePromyelocyticLeukemia

WANGYa-Zhe，CHANGYan，ZHUHong-Hu，QINYa-Zhen，LIJin-Lan，FUJia-Yu，LILing-Di，CHENShan-Shan，HUANGXiao-Jun，LUDao-Pei，LIUYan-Rong

InstituteofHematology，PeopleHospital，PekingUniversity，Beijing100044，China

AbstractThestudywasaimedtoinvestigatetheroleandsignificanceofCD123withotherimmunologicalmarkersindetectingminimalresidualdisease(MRD)ofAPLpatients.Theimmunophenotypesof186newlydiagnosedAPLpatientsandthepercentagesofcellsidenticalwithAPLcellimmunophenotypesin20normalbonemarrowsampleswereanalyzedusingfour-colorflowcytometry.MRDin172specimensweremonitoredmainlyusingCD34/CD117/CD123/HLA-DRfour-colorantibodypanels，meanwhile18specimenswereanalyzedwiththesecondantibodycombination:CD9/CD117/CD34/CD33，simultaneouslyandtheresultswerecomparedwithreal-timePCR.Onehundredandsixteenof172bonemarrow(BM)orperipheralblood(PB)specimenswerefromfollow-up19newlydiagnosedAPLpatientsandtherest56sampleswerefrom47patientstreated3to24monthslater.Amongthem，117samplesand55sampleswerecollectedafterachievingmorphologiccompleteremission(mCR)andbeforeachievingmCRrespectively.TheresultsofimmunophenotypingdemonstratedthatexceptCD9，CD33andCD117werehigh-expressedandCD34andHLA-DRwererarelyexpressed，theCD123wasexpressedin30/30(100%)APLpatients.ThepercentagesofCD117+CD34-CD123+HLA-DR-andCD117+CD34-CD9+CD33+cellsinnucleatedcellswere%±%and%±%in20normalbonemarrowsamples.Themediantimeofachievingmorphologycompleteremissionin19APLpatientswas4weeks(3-6weeks).ThemediantimeofFCMandPCRresultsturnedtobenegativein13APLpatientswasweeks(5-11)andthemediantimeofPCRresultsturnedtobenegativein11APLpatientswas8weeks(5-12).41/117(%)sampleswereMRDpositivebyFCMafterachievingmCR.TheratioofCD117+CD34-CD123+HLA-DR-cellswas5%in33specimens，but5%inanother8specimens，theirmedianpercentagesofCD117+CD34-CD123+HLA-DR-cellswere%(range%-%)and%(range%-%)respectively.ThemedianrelativepercentagesofCD123+HLA-DR-cellsinCD117+CD34-populationwere%(range%-%)and%(range%-%)respectively.InFCMMRDpositivesamples，%(93/97)werePCRpositive，thefalsepositiverateofFCMandthefalsenegativerateofPCRwere%(4/97)and%(7/93)respectively.InFCMnegativesamples，92%(69/75)werePCRnegativeand8%(6/75)werePCRpositive.ThepercentagesofCD117+CD34-CD123+HLA-DR-cellsin116consecutivespecimensand117specimensofmCRwererelatedtoPML/RARαquantifiedbyreal-timePCR(r=，andr=，respectively).ItisconcludedthatthedetectionofAPLpatientsbymeansoftwosetsofantibodypanelsissimpleandsuitable，whichiscomplementarytoPCRinmonitoringMRDofAPLpatients.

KeywordsCD123;acutepromyelocyticleukemia;minimalresidualdisease;flowcytometry

随着维甲酸和化疗的联合应用，90%的急性早幼粒细胞白血病(APL)患者获得完全缓解(CR)［1］，5年生存率明显提高，但仍有5%-15%的患者最终复发。导致复发的主要原因是微小残留病(MRD)的存在［2］，因此及早发现MRD并对其定量有助于评判预后、预防复发及选择个体化治疗方案。以往，由于流式细胞术(FCM)检测APL患者的灵敏度较低，难以确定MRD阳性患者。近年来，Jordan等［3］证实CD123是急性髓系白血病干细胞的一个独特标志，在正常造血干细胞上极少表达。目前，有关CD123在白血病免疫分型中作用的报道较少，而有关CD123在MRD检测中的作用尚未见有公开文献报道，本实验首先检测初治APL患者CD123的表达，并探讨CD123联合其它免疫标志在检测APL患者治疗后残留白血病细胞中的作用及意义，以便简单、快速、准确地运用FCM检测MRD，为临床提供治疗线索。

材料和方法

研究对象

对2001年7月至2005年5月在本院就诊的186例初治APL患者进行了免疫分型分析，对其中30例，中位年龄38岁，增加了CD123抗体检测，另男81例，女75例，中位年龄34(6-78)岁。对66例APL患者进行了FCMMRD检测，包括19例连续随访者，其中男34例，女32例，中位年龄37岁；对他们每隔1周收集外周血(PB)样品，每隔1月收集骨髓(BM)样品，共检测了116份标本，包括形态学完全缓解(CR)前55份，CR后61份，平均随访时间为周(8周-33周)。对47例CR后APL患者进行非连续随访，共收集56份骨髓标本，距初诊3个月至2年不等，并用2组抗体组合检测18份治疗后APL标本，其中15份形态学CR，3份未缓解。选择20名健康志愿者作为对照，其中男14例，女6例，中位年龄38(30-46)岁。

FCM免疫表型检测

免疫分型

取肝素抗凝骨髓血2ml，应用我室常规四色免疫分型方法对156例APL患者进行免疫分型分析［4］。对30例APL患者增加了CD123抗体检测。分析时以幼稚细胞群中抗原表达细胞20%作为阳性。

MRD检测

应用CD34/CD117/CD123/HLA-DR1组抗体组合检测66例APL患者治疗前后的172份标本，对其中18份标本增加另1组抗体组合检测即：

CD9/CD117/CD34/CD33检测。每管获取750000个细胞，采用CD117+/SSC值大和CD117+CD34-双设门，分析内容包括：①CD117+且SSC值大的细胞在有核细胞中所占比例;②CD117+且SSC值大的细胞中CD34-细胞在有核细胞中所占比例;③CD117+CD34-且SSC值大的细胞中CD123、HLA-DR或CD9、CD33抗原表达的相对比例，并乘以CD117+CD34-细胞的比例得到在有核细胞中所占实际比例。

正常骨髓中CD117阳性细胞的免疫表型检测

利用四色抗体组合分析了20例健康志愿者。检测的抗原包括CD117、CD3、CD7、CD9、CD19、CD13、CD33、CD34、CD38、CD56、CD123和HLA-DR。每管获取250000个细胞，分析方法同MRD检测。

APL特异性融合基因PML/RARα的实时定量PCR检测

采用实时定量PCR方法［5］检测66例APL患者172份标本中PML/RARαmRNA的表达。

统计学处理

采用SPSS分析FCM与PCR检测结果的相关性，t检验比较APL与正常人的抗原表达。正态分布资料采用平均值±标准差(x±SD)。

结果

APL患者免疫表型

186例APL患者免疫表型与以往结果一致，如多数患者表达CD117、CD33和CD9，而CD34和HLA-DR多为阴性(表1)。CD34和HLA-DR阴性的患者中CD34和HLA-DR的平均表达率为%和%。通过对CD123检测发现，30例患者全部为阳性。Table1.Expressionofsomeantigensinacutepromyelocyticleukemiapatients(略)

正常骨髓中CD117阳性细胞的免疫表型

CD117+、CD117+CD34-细胞在有核细胞中的比例及CD117+CD34-细胞中其他抗原在有核细胞中表达的实际比例见表2。此外，CD117+CD34-细胞中CD123+HLA-DR-和CD9+CD33+细胞平均相对比例分别为%和%。

APL患者骨髓与健康骨髓检测结果比较

19例初治APL患者经形态学检测的幼稚细胞平均数为%(%-97%)，FCM检测CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞平均比例为%(%-%)；20例健康志愿者的平均比例为%(%-%)，两者相差3个对数级(log)()。APL患者CD117+CD34-细胞中CD123+HLA-DR-细胞的平均相对比例为%±%，而健康志愿者为%±%，两者有显着差异()。这一抗体组合为较理想的检测MRD的组合。另外，健康志愿者CD117+CD34-CD9+CD33+细胞的比例也较低(表2和图1)，选择第2种抗体组合。其它抗体组合正常值较高，均不理想。Table2.AntigenexpressionofCD117+cellsinnormalbonemarrow(略）

FCMMRD检测

根据正常值范围和PCR检测的结果，确定患者获得形态学CR后微小残留病(MRD)阳性的标准为：①CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞实际比例≥%(平均值±2×标准差)(图2A)；②实际比例＜%，但CD117+CD34-细胞中CD123+HLA-DR-细胞的相对比例≥12%(平均值±3×标准差)(图2B)。

CD9/CD117/CD34/CD33组合检测MRD阳性的标准为：CD117+CD34-CD9+CD33+细胞实际比例≥%或CD117+CD34-细胞中CD9+CD33+细胞的相对比例≥28%。

19例随访患者获得形态CR的中位时间为4周(3-6周)，在CR前收集55份标本，经FCM检测CD117+CD34-细胞平均比例为%(%-%)，CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞平均比例为%(%-%)。

19例连续随访的患者中13例FCM检测结果转阴，转阴时间距初诊的中位时间为周(5-11周)，其余6例治疗6-8周后出院并未再复查或未到复查期。FCM检测结果转阴前共36/61份(59%)标本MRD阳性，其中8份CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞中位比例为%(%-%)，相对比例为%(%-%)；28份标本中位比例为%(%-%)，相对比例为%(%-%)，其中24例实际和相对比例均符合MRD阳性标准，4例实际比例不高但相对比例12%。非连续随访的47例患者FCM检测结果转阴时间距初诊的中位时间为月(3-24月)，共3例患者5份标本MRD阳性，阳性标本CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞的中位比例%(%-%)，中位相对比例为%(%-%)，其中3例实际比例%，但相对比例12%。5例患者中1例连续3份标本经FCM、PCR检测结果均为阳性，2周后均转阴；2例患者2份标本FCM检测结果为阳性，但PCR检测结果为阴性，其中1例4周后复查FCM和PCR检测结果均为阴性，另外1例未继续检测。表3显示41份MRD阳性标本的时间分布。76份MRD阴性，CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞的中位比例为%(%-%)，中位相对比例为%(%-%)。Table3.IncidenceofMRD+samplesinpatientswithAPLaftermorphologyremission

对14例患者CR后同时检测BM和PB标本，结果BM中CD117+CD34-细胞的比例是PB中比例的倍，CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞的实际比例是PB中实际比例的倍，但BM中CD123+HLA-DR-细胞的相对比例较PB低，是PB中相对比例的。

两组抗体组合检测发现，18份标本中3份在形态学上未CR，两组合中细胞实际比例均大于10%；形态学CR的15份标本中9份距初诊3-6周不等检测MRD同为阳性，CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞中位比例为%(%-%)，CD117+CD34-CD9+CD33+细胞中位比例为%(%-%)；5份标本距初诊6周后检测MRD同为阴性，两组合细胞中位比例分别为%(%-%)和%(%-%)；1份距初诊8周的标本在CD123组合中实际和相对比例均符合MRD阳性标准，但不像典型APL细胞，CD9组合中MRD阴性，可能是非特异性细胞黏附造成的假阳性。总之，两组合变化基本一致，但CD9组合较CD123组合细胞比例高，无显着性差异。

FCM与PCR检测结果的比较

19例连续随访患者经PCR检测11例转阴，中位转阴时间为8周(5-12周)。8例FCM与PCR检测结果同时转阴，3例于FCM检测结果转阴1-2周后PCR检测结果转阴。

19例随访患者形态学上CR和未CR的116份标本，其FCM与PCR检测结果的变化趋势基本一致，两者有一定的相关性(r=，，图3)。10例患者在距初诊2-4周和距形态学CR1-2周时PML/RARα平均升高了%(%-%)，与前1周相比，平均升高倍数为()，其中5例FCM结果也升高，但上升倍数为()。

172份标本中117份形态学CR和55份形态学未CR。对172份标本同时进行了FCM与PCR检测。结果显示，两种检测均为阳性的标本93份，其中7份PCR检测原为阴性，但6份标本内参弱，连续监测的前后1周PCR检测均为阳性，且5份PML/RARαmRNA水平均较高；另1份为PCR检测阴性的BM标本，同一天PB阳性，故认为此7例标本PCR检测为假阴性(%)，而以PCR阳性进行统计。由此得出，FCM(+)标本中%(93/97)PCR为阳性，4份标本PCR检测为阴性，假阳性率为%(4/97)。FCM(-)中，92%(69/75)PCR为阴性，8%(6/75)PCR为阳性。这些结果说明当FCM为阴性时，多数患者PCR也达到阴性水平，只有8%患者FCM阴性而PCR阳性，结果不同可能是因为两种方法的灵敏度不同所致，PCR的灵敏度高于FCM检测水平。Table4.ComparisonbetweenresultsbyFCMandPCR(略)

CR后FCM与PCR检测结果的比较表明，117份CR后标本FCM检测结果与PCR结果有一定的相关性(r=，)，部分患者两项检测结果不一致。通过FCM检测的发现，PCR的假阴性为%(7/93)。

讨论

急性早幼粒细胞白血病约占AML的10%-15%，化疗、维甲酸、砷剂和分子靶向药物的联合应用使APL患者的CR率达到较高水平，但并非所有患者能够长期生存，仍有部分复发，甚至威胁生命。MRD的存在是导致复发的主要原因。目前定量PCR检测PML/RARα是MRD检测的金标准，其最大优势是灵敏度高达10-4-10-5，但操作较烦琐、费时且标本量少、内参不好时易出现假阴性。目前定量PCR检测的是基因拷贝数，不同细胞该基因拷贝数不同，难以换算成细胞比例，定量较抽象；而PML/RARα阳性的初治患者基因表达量变异较大，治疗后难以确定复发阈值，由于其灵敏度较高，阳性时不一定预示复发。FCM检测MRD的主要优点是操作简单、快速，可反映白血病细胞比例，定量较直接，在检测ALLMRD时易确定复发阈值；缺点是灵敏度比PCR低，在ALL检测中可达10-4，而在AML中一般文献报道为10-3。由于缺乏理想的抗体组合，FCM检测APL患者MRD的灵敏度甚至低于10-3，限制了其应用。

文献报道［6］与本室［4］结果已证明，APL患者有较特异的免疫表型：SSC较大，CD34、HLA-DR多为阴性，高表达CD117、CD9、CD13、CD33、CD38。我们对正常骨髓的检测结果显示，具有APL免疫表型特点的细胞如：CD117+CD34-CD13+HLA-DR-、CD117+CD34-CD33+HLA-DR-、CD117+CD34-CD38+HLA-DR-细胞比例在正常骨髓中均较高(表2)，影响灵敏度，不适于MRD的监测。通过对30例初诊APL患者检测发现，CD123表达均为阳性，且平均阳性细胞数均高，APL患者骨髓幼稚细胞基本为CD117+CD34-CD123+HLA-DR-CD9+CD33+，正常人群中CD117+CD34-CD123+HLA-DR-和CD117+CD34-CD9+CD33+细胞比例较低，两者存在显着性差异()，这就为利用CD117+CD34-CD123+HLA-DR-和CD117+CD34-CD9+CD33+组合检测APL中的微小残留病奠定了基础。

确定MRD的阳性标准是FCM检测MRD的前提，不同实验室的报道不相同［7］。本实验根据正常骨髓CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞的实际比例和PCR检测结果首先确定MRD阳性标准：实际比例≥平均值+2×标准差(%)。7份标本实际比例%，但CD123+HLA-DR-细胞的相对比例≥12%，参考PCR结果，我们确定实际比例%时若相对比例≥平均值+3×标准差(12%)，也应认为MRD阳性。7份标本实际比例太低的原因可能是骨髓受抑制，导致CD117阳性细胞数量低。

本研究证明，患者获得CR后3周左右FCM检测结果即可转阴，且多数患者在FCM结果变为阴性时PCR检测结果同时转阴，这说明多数患者在短期内获得基因缓解。个别患者FCM和PCR检测转阴时间较长，其预后意义尚需观察。

根据两项MRD标准，FCM检测MRD阳性而PCR阴性的标本4份，假阳性率为%(4/97)。经FCM检测发现，PCR检测的假阴性率为%。个别患者在第2周时PCR结果由初治的%降为%，第3周又升为81%，而FCM检测第2周时白血病细胞无明显减少，考虑第2周时PCR结果有问题。以上说明两项检测可相互补充各自缺陷。FCM阴性的75份标本中共有6份(8%)PCR阳性，PML/RARα%，这并非FCM的假阴性结果而是由于PCR检测的灵敏度高于FCM，这说明此6份标本的MRD水平低于FCM检测水平，而高于PCR检测灵敏度。

同时进行FCM与PCR检测发现，两者具有一定相关性。正常骨髓中有%±%细胞表型为CD117+CD34-CD123+HLA-DR-，当残存的具有此表型特点的APL细胞在此范围或低于此值时，FCM则不能精确反应MRD的实际水平。与PCR进行比较时发现，当PML/RARα1%时，CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞比例不随PML/RARα减少而减少。本研究中有18份标本PML/RARα1%，其中13份FCM阳性，5份FCM阴性。此结果说明PML/RARαmRNA水平较低时FCM检测可能出现阴性结果。10例随访患者在获得CR前后出现PML/RARαmRNA水平明显升高，7例甚至超过初诊时水平，其中5例伴FCM检测结果上升，但上升倍数较PCR低，其原因不明，经分析发现mRNA水平的升高与外周血WBC数，骨髓和外周血幼稚细胞和粒细胞比例无明显相关。此现象是否为化疗导致PML/RARαmRNA水平增加，尚需实验证明。14例形态学CR患者的BM中CD117+CD34-细胞、CD123+HLA-DR-细胞的实际比例及PML/RARαmRNA水平大于同一天的PB标本，但相对比例低于PB，此现象的可能原因是骨髓处于恢复期，正常增殖的CD117+CD34-细胞混于其中使CD123+HLA-DR-细胞比例相对下降，这进一步说明考虑把相对比例作为阳性标准的必要性。

CD9/CD117/CD34/CD33组合虽不如CD34/CD117/CD123/HLA-DR组合敏感度高，但同时应用可增加结果的可靠性。

综上所述，CD123的应用为FCM快速、准确、高效地检测APL中的残留白血病细胞提供了可能，两组合联用可以与PCR相互补充、弥补不足，进一步提高诊断的准确性。考察患者MRD水平变化的主要目的是指导治疗，由于随访时间短，MRD阳性及其早期变化对预测患者复发、对总生存率、无病生存率的影响还需进一步追踪研究。

【参考文献】

1FenauxP，ChastangC，ChevretS，etal.Arandomizedcomparisonofalltransretinoicacid(ATR