第四章 基因工程（背诵版）【 核心知识每日必背 】高二生物 提升必背（浙科版2019选择性必修3）

第四章基因工程【课前检测】【例1】核移植前应增加转基因细胞培养液中的血清浓度以提高动物克隆成功率（）why？答案：（x）why？在移植过程中无需提高血清浓度,动物培养液中血清的作用是保证细胞能够顺利生长和增殖,属于营养物质【例2】引物能引导限制酶精准确定目的基因的位置,其原理是,限制酶的作用是答案：引物与目的基因能够进行碱基互补配对，特异性识别特定的核苷酸序列并在特定位置切割磷酸二酯键【例2】在转基因浮萍的培育过程中,科研人员用PCR技术持异性快速扩增了目的基因。已知PCR引物序列如图所示,并在每种引物的5'端设计了特定序列引物1:GGAAGATCTTCCCGCGGATCCATGGACTATAATGTATGGA引物2:AAACTGCAGTTAGATTCTAGAGGGAATGA两种引物设计的依据是,设计加下划线的特定序列的目的是答案：两种引物设计的依据是目的基因两端的部分DNA序列,设计加下划线的特定序列的目的是使扩增出的目的基因两端含有相应限制酶的识别序列和切割位点【基因工程—原理：基因重组，构建基因表达载体——核心】①限制酶/限制性内切核酸酶：主要存在于？细菌功能？特异性识别特定的核苷酸序列并在特定位置切割磷酸二酯键【例】为什么原核生物的限制酶无法切割自身DNA?答案：1.无限制酶识别的相应的核苷酸序列2.DNA经化学修饰【判断】限制酶只对双链起作用，对单链不起作用？√一种限制酶可以识别多个序列？√不同的限制酶可以识别同一序列？√意义？适应不同的反应体系的温度、pH【例】目的基因：使用两种的限制性内切核酸酶切割（注意保证目的基因的完整）——防止目的基因自身环化和反向连接【例】使用相同的两种的限制性内切核酸酶切割利于目的基因和载体质粒的正向连接。【例】使用相同的限制性内切核酸酶切割利于目的基因和载体质粒的连接。②DNA连接酶——连接DNA片段之间的氢键——酶具有专一性?种类：T4DNA连接酶——连接黏性末端和平末端EcoilDNA连接酶——只连接黏性末端③载体的种类：质粒/噬菌体——受体细胞：细菌植物病毒——受体细胞：植物细胞动物病毒——受体细胞：动物细胞理想载体的特征：1.复制起点2.有限制酶的识别序列3.具有筛选作用的目的基因获取目的基因化学合成法/PCR技术——已知目的基因全部序列（适合较短的基因）基因文库——未知目的基因序列：（基因组文库、cDNA文库）【例】当目的基因序列未知，获取目的基因时，可以建立cDNA文库：（以抗体基因为例）抗体基因可从B淋巴细胞/效应B淋巴细胞中提取并纯化全部mRNA，并以此为模板，利用逆转录酶合成cDNA（单链）——不同组织细胞的cDNA文库是不同的，why？同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库也会有差异——原因：基因的选择性表达胰岛素基因的cDNA——只存在于有胰岛β细胞建立的cDNA文库，【判断】胰岛素基因只存在于胰岛β细胞——x（一般来说，同一个体所有细胞的核遗传信息相同）3.【PCR技术（已知或未知基因序列）—聚合酶链式反应—体外扩增DNA—增加基因含量】PCR以待扩增DNA为模板，原理：dNTP(脱氧核苷三磷酸)，耐高温的TaqDNA聚合酶引物：2条不同的DNA单链——两个引物决定扩增DNA的起点和终点（√）一个基因连续扩增4次，需要几个引物？2*4x2-2=30【例】一个基因连续扩，第n次时需要消耗引物Ⅰ___2n-1____个。若计划用1个目的基因为模板获得m（m大于2）个目的基因，则需要的引物总量是2m-2个。【例】（拓展目的基因利用PCR技术扩增的时候——为便于能与酶切后的质粒连接，引物在设计的时候加入限制酶识别特定的核苷酸序列）PCR的过程：变性：90-95℃高温——氢键断裂——解旋形成2条DNA单链——PCR不需要解旋酶退火：50-60℃降温——加入引物——与模板碱基配对——形成氢键延伸：72℃适当升温——加入TaqDNA聚合酶、dNTP——形成磷酸二酯键反复循环多次④PCR的结果PCR产物的鉴定——DNA分子杂交/核酸分子杂交/电泳技术——分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质基因表达载体的构建——核心相同两种限制酶切割目的基因和载体产生2种的黏性末端DNA连接酶连接形成重组DNA分子④可在微生物细胞中扩增（无性生殖）获得大量重组质粒（建立基因文库）/PCR技术体外扩增表达载体的组成：①有限制性内切核酸酶的识别序列——利于限制酶识别与切割，利于与目的基因的连接②标记基因（包括抗性基因/荧光蛋白基因）——便于筛选③启动子/终止子：转录的起点/终点——与基因的表达有关④复制起点——利于目的基因的扩增双酶切问题双标记问题二次酶切问题（拓展）双标记问题：——确保目的基因导入质粒与单标记相比，如将目的基因插入抗四环素抗性基因里面，该微生物表现抗青霉素，不抗四环素——导入成功抗青霉素，抗四环素——未导入双标记问题：使用酶I+II(1个用于标记，1个用于插入目的基因——保证构建的重组质粒够利用标记基因筛选出来)导入受体细胞：植物：农杆菌转化法动物：显微注射法（导入受精卵/胚胎干细胞——具有发育的全能性）微生物：感受态细胞法感受态细胞法：处于能吸收周围环境中DNA分子的状态的细胞(感受态)原理:低温，低浓度CaCI2处理大肠杆菌，细胞体积增大，细胞膜通透性变大。①低温，低浓度CaCI2处理：Ca2+帮助DNA吸附在细胞膜上↓②短暂热刺激处理：使重组质粒进入受体细胞加入液体培养基中（不含抗生素）——摇床慢速培养一段时间（恢复正常状态）显微注射法：将重组DNA分子导入受精卵——经胚激活、胚胎体外培养、胚胎移植技术——获得转基因动物农杆菌转化法：目的基因——经感受态细胞法——导入农杆菌——农杆菌的Ti质粒的T-DNA携带目的基因——农杆菌侵染——创伤处理的植物细胞的染色体/基因组DNA中——作用完后农杆菌要用抗生素杀死（防止农杆菌大量繁殖对植物细胞的破坏）——处理后的植物细胞——（经过植物组织培养）——完整植株（植物细胞的全能性）（拓展）受体细胞的要求：优良性状、较高的遗传稳定性、全能性表达充分、易被农杆菌侵染3.对受体细胞的要求：受体细胞繁殖快，能表达转入的基因，最好是一种缺陷型，转入基因后才能存活，方便筛选，安全无污染【例】若植物材料对农杆菌不敏感，则可用显微注射法的转基因方法。【例】利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是____吸引农杆菌，利于农杆菌入侵植物细胞______________________。四、表达与鉴定基因表达——转录+翻译：目的基因必需和启动子部位结合，构建出特异性表达载体。基因剔除——使得被剔除的基因无法表达（拓展）完成筛选后，有些需要剔除标记基因——防止其流入其他食物导致安全性问题检测目的基因是否导入的方法：PCR技术/核酸分子杂交检测目的基因是否表达的方法：检测RNA——核酸分子杂交检测蛋白质——抗原—抗体杂交（使用单克隆抗体作为特异性探针）个体性状检测：抗虫实验（药物检测）：如治疗新冠的药物：对经治疗的个体进行感染新型冠状病毒处理，观察病症并测试药物的活性/敏感性（胚胎干细胞）——具有发育的全能性——取自囊胚期的内细胞团——可以发育成成体的作用组织和器官（胚胎分割）切割针/胰蛋白酶酶解法——处理内细胞团（囊胚期不能使用酶解法）【例】转入了人胰岛素原基因的大肠杆菌，可以合成人胰岛素原，转入了人胰岛素原基因的酵母菌，可以合成胰岛素why？酵母菌中含有高尔基体和内质网，可以对蛋白质经进一步加工后可获得具有生物活性的胰岛素。【例】目的基因导入受体细胞中不能稳定表达的原因：没有启动子、终止子、没有复制原点、没有拼接到受体细胞DNA上【例】在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是___________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是__________________________。【答案】（1）嫩叶组织细胞易破碎 防止RNA降解【工程菌和生物反应器】比较项目工程菌生物反应器基因结构必需除去内含子可以不除去内含子基因表达无蛋白质的加工有蛋白质的加工受体细胞微生物细胞动物的受精卵目的方式感受态细胞法显微注射法生产条件微生物培养环境动物饲养环境药物提取从微生物细胞中提取从动物分泌物中提取【判断】动物乳腺生物反应器所用的目的基因的受体细胞是乳腺细胞x膀胱生物反应器所用的目的基因的受体细胞是膀胱细胞x【例】与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产药物W的优势在于不受转基因动物的______________（答出2点即可）的限制。答案：性别+发育时期一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息________________（填相同或不同），原因是_________。答案：相同，来源于同一个受精卵【例】以乳腺作为生物反应器的优点：答案：乳汁可以连续合成、频繁采集不会对动物产生危害、乳汁成分相对简单、明确、便于药物的提纯【例】由于导入新的外源基因，转基因作物获得或增强生存竞争和繁殖能力，使其在很多方面都强于亲本或野生种。【基因诊断和基因治疗】基因诊断：判断患者是否出现了基因异常或携带病原体应用：①产前基因诊断——遗传病②基因检测——传染病方法:分子杂交技术(2)基因治疗①治疗疾病:遗传性疾病②治疗方法:将正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。受体细胞一般为体细胞而不是受精卵，基因治疗后只有一部分细胞含有正常基因。导入的载体可以选用？经修饰过的病毒，如腺病毒、逆转录病毒【例】基因治疗过程中，是否需要修复不正常基因?不能改良的性状是否可遗传给后代?不能【蛋白质工程】 找到相应脱氧核苷酸序列←推测氨基酸序列 ←设计蛋白质结构←预期蛋白质功能 【例】（2019江苏卷·16）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是（）A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗【答案】D【例】烟草DNA分子被“嫁接”上或“切割”掉某个基因，但并不影响该基因的表达，从基因功能角度考虑，说明____________________________。答案：基因时控制生物性状的结构和功能单位，具有相对独立性【例】真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用__蛋白酶缺陷型____的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加____蛋白酶__的抑制剂。17.(2019·嘉善高二检测)图1表示某质粒，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和LacZ基因，LacZ基因能合成β－半乳糖苷酶，该酶能将白色底物X－Gal转化为蓝色产物。图2表示含目的基因的DNA片段，实验小组利用该质粒为载体将目的基因导入大肠杆菌，并筛选成功导入重组质粒的受体细胞(ScaⅠ、ApaⅠ、EcoRⅠ表示限制性核酸内切酶切割位点)。请回答下列问题：（1）构建重组DNA分子的目的是_______使目的基因在受体细胞中稳定地复制并表达_。在构建重组DNA分子时应选用的限制性核酸内切酶是ApaⅠ和EcoRⅠ__(2)将重组质粒导入大肠杆菌时，应用_氯化钙_______处理大肠杆菌，制备感受态细胞，实验室选用微生物作为受体细胞的优点是____繁殖速度快、多为单细胞、遗传物质相对较少(3)重组质粒导入大肠杆菌后，应将大肠杆菌置于以X－Gal为底物，并添加_____氨苄青霉素_________的培养基上培养，挑选出___A_____(A.白色B.蓝色)菌落。(4)检测目的基因是否成功导入受体细胞常用的方法是____DNA分子杂交技术________________________，该方法依据的原理是____碱基互补配对__。【例】为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为_______基因组文库