鸽子性别鉴定的PCR方法

I鸽子性别鉴定的PCR方法范围本标准规定了鸽子性别鉴定的PCR操作方法。本标准适用于各种品类、各日龄鸽子的性别鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范试剂或材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验室用水均符合GB/T6682二级水规定。肝素钠：配制方法见附录A.1。TAE电泳浓缩缓冲液：配制方法见附录A.2。X脂糖：配制方法见附录A.3。雄性鸽子对照、雌性鸽子对照均为已知性别的鸽子全血DNA作为模板，-20℃保存。仪器设备4℃冰箱（温控范围2℃～8℃）。离心管（1.5mL～2mL）。PCR仪。电泳仪（电压90V～120V）。凝胶成像仪。高压灭菌锅（灭菌温度：105℃～135℃；工作压力：≤0.35MPa）。微量移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）及配套吸头。样品采集、储存及运输按NY/T541—2016规定进行采样。用无菌针头于鸽子爪处刺破皮肤，吸取20μL全血并与3μL～5μL肝素钠（参见附录A.1）混合，编号。样品采集和样品处理应戴一次性手套，不得交叉污染。采集的样品储存和运输，参见NY/T541—2016。试验步骤本实验具体实验操作符合GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求。引物参照参考文献（刘宏祥等，2013），合成针对鸽子雌雄性别染色体CHD基因的一对引物（A1/A2）作为鸽子性别鉴定的引物，引物序列参见附录B。PCR扩增PCR反应总体积为25μL，引物为A1/A2，模板为采集的鸽子抗凝全血，PCR反应体系参见附录C。PCR反应条件为95℃5min、55℃5min循环2次裂解红细胞，释放DNA，然后94℃预变性5min，94℃40s、50℃30s、72℃40s，循环扩增31次，最后72℃延伸7min。同时设立雄性和雌性鸽子的DNA为对照。PCR产物电泳取8μLPCR扩增产物，进行1.2%的X脂糖凝胶电泳（120V，30min～50min）。电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果，拍照并做好试验记录。结果判定试验成立条件雄性对照的PCR产物电泳后，在600bp的位置出现一条特异性的扩增条带，雌性对照PCR产物电泳后在450bp和600bp处均有扩增条带，试验结果成立。否则试验结果不成立。（见附录D）结果判定雄性：检测样品PCR产物电泳后，仅有600bp的一条带，则鸽子性别为雄性。雌性：检测样品PCR产物电泳后，有450bp和600bp的两条带，则鸽子性别为雌性。

（规范性附录）

溶液配制肝素钠抗凝剂150mg肝素钠粉末（150U/mg）与100mL生理盐水混合溶解。TAE电泳缓冲液使用时将50倍TAE电泳浓缩缓冲液用去离子水50倍稀释即可。50倍TAE电泳浓缩缓冲液配制方法为：取Tris碱242g去离子水溶解，加入冰醋酸57.1mL、0.5mol/LEDTA100mL，用5mol/L的NaOH调pH至8.0，定容至1000mL。1.2%X脂糖凝胶称取1.2gX脂糖，加入100mLTAE缓冲液中加热溶解，最后加入适量核酸染料。2×TaqMasterMix成分TaqDNAPolymerase

0.1U/μLMgCl23mMdNTPs0.4mM2×PCR反应缓冲液

（规范性附录）

PCR引物序列PCR引物序列见表B.1。PCR引物序列引物（primer）序列（sequence）A15'-AGTGCATTGCAGAAGCAATATT-3'A25'-GCCTCCTGTTTATTATAGAATTCAT-3'

（资料性附录）

PCR反应体系PCR反应体系见表C.1。PCR反应体系组分体积（μL）水10.32×Mix12.5上游引物（25μmoL/L）1.0下游引物（25μmoL/L）1.0模板0.2总体积