基因工程的理论基础与基本技术

基因工程的理论基础与基本技术第一页，共四十八页，编辑于2023年，星期日第二章基因工程的理论基础与基本技术

第二页，共四十八页，编辑于2023年，星期日第一节基因工程的理论基础第三页，共四十八页，编辑于2023年，星期日（一）原核生物的基因结构特点1.操纵子结构

操纵子（Operon），由几个功能相关的结构基因成簇排列而组成的一个基因表达的协同单位（coordinatedunite），称为操纵子。

一基因结构特点调节基因启动子操纵基因结构基因第四页，共四十八页，编辑于2023年，星期日大肠杆菌乳糖操纵子

第五页，共四十八页，编辑于2023年，星期日色氨酸操纵子

第六页，共四十八页，编辑于2023年，星期日第七页，共四十八页，编辑于2023年，星期日2.原核细胞mRNA的特征（1）半衰期短（2）多顺反子形式

（3）存在SD序列

原核生物中起始密码子AUG上游7～12个核苷酸序列因其与16SrRNA3’末端反向互补而被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。

（4）起始密码子常为AUG（有时GUG，甚至UUG）。第八页，共四十八页，编辑于2023年，星期日3.原核细胞基因的终止子根据对细菌和噬菌体DNA模板上的终止信号的分析，发现它们具有共同的结构特征：①终止点上游存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构；②在终止点前面有一段由4～8个A组成的序列，因此转录产物的3’端为寡聚U。

UUUUUUUUUUUURNA第九页，共四十八页，编辑于2023年，星期日（二）真核生物基因的结构特点1.真核生物基因的不连续性断裂基因（interruptedgene）

第十页，共四十八页，编辑于2023年，星期日内含子是一个基因中非编码DNA片段，它分开相邻的外显子。

外显子是一个基因中编码蛋白序列。严格地说,外显子是指保留在初级mRNA中不被剪切掉的区域,包括5’非翻译区(5’UTR)、编码序列和3’非翻译区(3’UTR)。

外显子-内含子连接区是指外显子和内含子的交界，又称边界序列。GT-AG法则

序列分析表明，几乎每个内含子5’端起始的两个碱基都是GT，3’端最后两个碱基总是AG，由于这两个碱基的高度保守性和存在的广泛性，有人把它称为GT-AG法则，即：5’GT…AG3’。

第十一页，共四十八页，编辑于2023年，星期日第十二页，共四十八页，编辑于2023年，星期日卫星DNA真核生物基因组中高度重复的DNA,有一些20～30bp的极短序列，且以数千个拷贝的串连方式排列，这种序列称为卫星DNA。2.卫星DNA在染色体DNA片段的氯化铯密度梯度离心中，由于浮力密度的不同，这种重复序列在主带DNA附近出现的卫星带，因此称之为卫星DNA。第十三页，共四十八页，编辑于2023年，星期日3.真核生物mRNA的特征（1）5’端的帽子结构

几乎全部的真核mRNA端都具“帽子”结构。虽然真核生物的mRNA的转录以嘌呤核苷酸三磷酸（pppAG或pppG）领头，但在5’端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7GpppAGpNp）。mRNA5’端的这种结构称为帽子（cap）。不同真核生物的mRNA具有不同的帽子。

第十四页，共四十八页，编辑于2023年，星期日(1)有助于mRNA越过核膜，进入胞质；(2)保护5′不被核酶降解；(3)翻译时供IFⅢ（起始因子）和核糖体识别，是翻译所必需的。第十五页，共四十八页，编辑于2023年，星期日（2）3’末端Poly（A）尾巴除了组蛋白以外，真核生物mRNA3’末端都有由40~200个A组成的Poly（A）尾巴。Poly(A)尾不是由DNA编码的，而是转录后的前体mRNA以ATP为前体，由RNA末端腺苷酸转移酶，即Ploy(A)聚合酶催化聚合到3’末端。

第十六页，共四十八页，编辑于2023年，星期日Poly（A）尾巴在基因工程操作中的作用：A、用Poly（T）作为合成cDNA第一链的引物。B、用Poly（T）纯化柱从总RNA中分离mRNA寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式；它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。mRNA刚从细胞核进入细胞质时，其多聚(A)尾巴一般比较长，随着mRNA在细胞质内逗留时间延长，多聚(A)逐渐变短消失，mRNA进入降解过程。它可促进核糖体的有效循环。Poly（A）尾巴有三个方面的功能：第十七页，共四十八页，编辑于2023年，星期日寡聚（dT）-纤维素柱层析法常规方法RNA(高盐缓冲液)寡聚（dT）纤维素柱低盐溶液和蒸馏水洗脱较高纯度的mRNA加样结合第十八页，共四十八页，编辑于2023年，星期日DynabeadsOligo(dT)25是一种直径为2.8μm的均一的、超顺磁的微球体，其表面的5’连接键共价结合了由25个脱氧核糖核苷组成的长链。

mRNA磁珠分离法

第十九页，共四十八页，编辑于2023年，星期日二从DNA到蛋白质（一）中心法则1970年特明(H.M.

Temin)以在劳斯肉瘤病毒内发现逆转录酶这一成就进一步发展和完善了“中心法则”。第二十页，共四十八页，编辑于2023年，星期日（二）基因表达从DNA到蛋白质的过程称为基因表达。

DNARNA转录翻译蛋白质第二十一页，共四十八页，编辑于2023年，星期日原核生物和真核生物比较1.启动子第二十二页，共四十八页，编辑于2023年，星期日2.RNA聚合酶原核生物真核生物RNA聚合酶仅一种RNA聚合酶有三种RNA聚合酶Ⅰ大部分rRNARNA聚合酶ⅡmRNA和snRNARNA聚合酶ⅢtRNA和5sRNA全酶的组成是α2ββ'σ

第二十三页，共四十八页，编辑于2023年，星期日3.表达过程原核生物真核生物无细胞核，转录和翻译几乎同时进行，基因表达的调控主要发生在转录水平。有细胞核，转录在细胞核中，翻译在细胞质中，并且转录和翻译后都有加工过程，基因表达的调控可以发生在各种不同水平。第二十四页，共四十八页，编辑于2023年，星期日4.表达的调控（1）真核生物的表达调控信号转导转录因子信号分子受体分子离子通道第二信使分子蛋白激酶或磷酸酯酶活性转录因子基因表达第二十五页，共四十八页，编辑于2023年，星期日（2）原核生物的表达调控①代谢物对基因活性的调节

第二十六页，共四十八页，编辑于2023年，星期日可诱导调节是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。可阻遏调节中的基因平时都是开启的，处在产生蛋白质和酶的工作过程中，但由于一些特殊代谢物或化合物的积累将其关闭，阻遏了基因的表达，所以称为可阻遏基因。第二十七页，共四十八页，编辑于2023年，星期日②弱化因子对基因活性的影响

第二十八页，共四十八页，编辑于2023年，星期日③降解物对基因活性的调节

添加葡萄糖能量得到满足细菌的腺苷酸环化酶抑制环腺苷酸(cMAP)↓cAMP＋受体蛋白↓调控的基因就不表达第二十九页，共四十八页，编辑于2023年，星期日④细菌的应急反应

氨基酸饥饿

空载tRNA

鸟苷四磷酸（ppGpp）鸟苷五磷酸（pppGpp）

关闭一些基因的表达开启氨基酸合成基因的表达生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止

第三十页，共四十八页，编辑于2023年，星期日⑤环腺苷酸受体蛋白对转录的调控

葡萄糖缺乏cAMP合成↑cAMP受体蛋白促进RNA聚合酶结合一些基因的启动子抑制RNA聚合酶结合一些基因的启动子第三十一页，共四十八页，编辑于2023年，星期日总结基因工程操作中应注意的真核生物与原核生物的差异1.基因结构的差异2.启动子和RNA聚合酶的差异3.蛋白质的翻译后修饰加工（前体切割、二硫键、糖基化、甲基化、羰基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、豆冠酸化、软脂化）4.基因表达的调节（表达量）5.载体的差异6.蛋白质的纯化方便第三十二页，共四十八页，编辑于2023年，星期日1．遗传密码与信息流

储存在DNA上的遗传信息通过mRNA传递给蛋白质，mRNA与蛋白质之间的联系是通过遗传密码的破译来实现的。mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为密码子，也叫三联子密码。蛋白质是通过遗传信息流由基因控制的。三基因研究进展第三十三页，共四十八页，编辑于2023年，星期日2．结构基因和调节基因

结构基因(structuralgene)是可以转录成为各种RNA(如rRNA、tRNA、snRNA)直接行使功能，或者转录成信使RNA(mRNA)然后翻译成多肽链，最终形成各种功能蛋白质和酶。

从广义上讲，任何一种能够调节或限制其他基因活性的基因都可叫做调节基因(regulatorygene)，一般情况下则是指基因产物参与调节别的基因活性的基因(如阻遏基因等)。首先转录成mRNA，然后由mRNA翻译成阻遏蛋白质或激活蛋白质，通常也称为转录因子或反式作用因子。它们通常结合到结构基因的非编码区的顺式元件上起调控作用。第三十四页，共四十八页，编辑于2023年，星期日3．管家基因和奢侈基因

具有相同遗传信息的个体细胞间其所利用的基因并不相同，有的基因活动是维持细胞基本代谢所必需的，而有的基因则在一些分化细胞或受到外界刺激的细胞中活动。前者称为管家基因(house-keepinggene)，如编码核糖体蛋白、线粒体蛋白、糖酵解酶等的基因；而后者被称为奢侈基因(1uxurygene)，第三十五页，共四十八页，编辑于2023年，星期日4．移动基因

1967年在大肠埃细菌的乳糖操作子的研究中第一次发现了称为插入序列(insertionsequence，IS)的转座因子。直至1980年夏皮罗(Shapiro)等人证实了可移位的遗传基因存在，说明某些基因具有移动性。转座子也称易位子，是由两个重复顺序夹着一个或多个结构基因组成。有的转座子的重复序列就是IS。转座子也和IS一样，能从一个位点转座到另一个位点，或从一个复制子转座到另一个复制子。转座子属于可移动的遗传因子—移动基因。除了转座因子外，病毒和质粒都是染色体外的可以移动的遗传物质，都必须依赖宿主而复制。第三十六页，共四十八页，编辑于2023年，星期日5．重叠基因

核苷酸序列是彼此重叠的两个基因称为重叠基因(overlappinggenes)或镶嵌基因(nestedgenes)。第三十七页，共四十八页，编辑于2023年，星期日第三十八页，共四十八页，编辑于2023年，星期日6．假基因

假基因是多基因家族中的成员，因其碱基顺序发生某些突变而失去功能，不能表达或表达异常，生成无生物活性的多肽。假基因DNA顺序可在相应基因名称之前加φ表示，如α珠蛋白基因家族中φξ1与功能性ξ2基因同源，φξ1有3个碱基被取代，其中密码子6的GAG—TAG(谷氨酸→终止密码)发生无义突变。第三十九页，共四十八页，编辑于2023年，星期日例如，在珠蛋白、免疫球蛋白、组织相容性抗原(histocompatibi1ityantigen)以及肌动蛋白和微管蛋白等基因家族(genefamily)中，都存在着这样的功能失活的假基因。

第四十页，共四十八页，编辑于2023年，星期日(1)重复的假基因

许多假基因都是同“亲本基因”(Parental8ene)连锁的，而且同其编码区及侧翼序列的DNA具有很高的同源佳。可见产生此种类型的假基因拷贝的一种可能的机理是，由含有“亲本基因”的染色体区段串联重复形成，故称之为重复的假基因。珠蛋白基因家族中的假基因即属于这一种类型。第四十一页，共四十八页，编辑于2023年，星期日第四十二页，共四十八页，编辑于2023年，星期日

(2)加工的假基因

除了重复的假基因外．在真核生物的染色体基因组中还存在着一类加工的假基因(processedpseudogene)。这类假基因没有与“亲本基因”连锁，而且其结构是同转录本而非“亲本基因”类似。例如，它们都没有启动子和间隔子，但在基因的3’—末端则都有一段延伸的腺嘌呤短序列，恰似mRNA分子3’—末端的poly(A)尾巴。这些特征表明，此类假基因很可能是来自加工的RNA之DNA拷贝，因此称之为加工的假基因。

第四十三页，共四十八页，编辑于2023年，星期日第四十四页，共四十八页，编辑于2023年，星期日7．串联基因簇

中度重复DNA有许多类型的重复序列组成。多重复序列组成的基因簇在重复区域的下游出现，这些通常是其产物需求量很高的基因，rDNA(编码rRNA)就是其中一例。编码18S、5.8S和28SrRNA的45S前体的基因就有约10～10000个拷贝的重复序列，其拷贝数因物种而异。人类基因组中45S基因在5个不同的染色体上都有排列，每一排列包含约40个拷贝。在分裂间期这些区域都处于核仁区，核仁是细胞核中的致密区域，是rRNA合成和修饰的工厂。另一个串联基因簇的例子是组蛋白基因，其产物在S期大量产生，5种组蛋白基因在一个基因簇，有的可直接重复达数百次。第四十五页，共四十八页，编辑于2023年，星期日8．基因组

基因组(genome)是1924年提出的，是指一个生物体、细胞器或病毒的全部基因。原核生物基因组仅由一条环状的双链DNA分子组成，含有一个复制起点，它的基因组就是它的整个染色体。但对于二倍体的高等生物，能维持配子体正常功能的最低数目的一套染色体构成的一个基因组。对于植物细胞而言，则有3个基因组，即染色体基因组(核基因组)、线粒体基因组和叶绿体