HPLC检测食品中的四种磺胺类兽药

高效液相色谱法检测四种磺胺类兽药残留磺胺类药物

主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺眯、菌得清、新诺明等。近年来，磺胺类药物在动物性食品中的残留超标现象，在所有兽药当中是最严重的。长期摄入含磺胺类药物残留的动物性食品后，药物可不断在体内蓄积。磺胺类药物的毒性作用损害泌尿系统

磺胺类药主要经肾脏排出，在尿中浓度较高，其溶解度又较低，尤其当尿液偏酸性时，可在肾盂、输尿管或膀胱内析出结晶，产生刺激和阻塞，造成泌尿系统损伤，引起结晶尿、血尿、管型尿。

引起过敏反应抑制造血系统导致细菌产生抗药性磺胺类药物结构

磺胺类药物的基本结构为对氨苯磺酰胺，简称磺胺的衍生物，具有芳氨基和磺酰胺基，多为两性化合物。常用的磺胺类药物的化学结构式：

磺胺类药物的分子结构

磺胺类药物在兽医临床上的应用

磺胺药对大多数革兰氏阳性和阴性细菌都有抑制作用，在食源性动物的饲养中，磺胺类药物不仅作为兽药被广泛用于兽医临床对细菌感染性疾病的防治，有时也被用作饲料添加剂。磺胺药的药代动力学

磺胺药主要在肝脏中代谢，常见的方式是在对位氨基处发生乙酰化，其次是羟基化作用。有的磺胺药其乙酰代谢物的水溶性低，易在肾小管内析出结晶，而有些代谢物虽水溶性较高，但在酸性尿中也容易结晶析出，容易引起结晶尿和肾并发症。磺胺类药物对食品的污染使用过磺胺类药物的动物，如果不遵守适当的休药期，其肌肉组织、蛋和奶中就会被残留的磺胺类药物污染；短期大剂量或长期小剂量给药，很容易造成磺胺类药物在动物各组织中蓄积；当饲料或饮水被磺胺类药物污染后，也可导致动物性食品中磺胺类药物残留量严重超标；很多研究表明猪肉及其制品中磺胺药物超标现象时有发生，特别是致癌性的磺胺二甲基嘧啶残留给人类的健康带来了威胁。食品中磺胺类药物的最高残留限量英、美等国家对磺胺类药物在肉类及乳品中的允许残留量限制为100µg·kg-1；欧盟第675/92号令中规定了，在肉类及牛奶中磺胺的最大残留总量不得超过100µg·kg-1；日本要求的最高残留限量更严格，单个磺胺残留限量为20µg·kg-1，最大残留总量不得超过100µg·kg-1；我国对磺胺类药物在肉类及乳品中的允许残留量限制为100µg·kg-1。提取和净化方法

磺胺类药物不易溶于非极性溶剂，而在极性较大的溶剂中溶解性较好，一般常用乙睛、氯仿、二氯甲烷、丙酮、或乙酸乙酯提取。净化方法主要有柱色谱，TLC，液液萃取（LLE），固相萃取（SPE）和基质固相分散萃取（MSPD）等。

磺胺类药物的HPLC法色谱条件常采用反相硅胶柱对待测物进行分离，主要有C18，C8或者C4柱，有时也采用离子对色谱柱。流动相主要由乙睛-水，甲醇-水或者乙睛-甲醇-水按不同比例组成，也有文献报道采用乙醇-水系统。在以上流动相系统中加入适量乙酸或者十二烷基磺酸钠（SDS）常用于提高分离效率。目前常用磺胺类兽药的检测方法分光光度法气相色谱法高效液相色谱法酶联免疫吸附分析法高效液相色谱与质谱联用分析法实验目的了解检测磺胺类兽药残留的方法，掌握高效液相色谱法检测磺胺类兽药残留的方法；了解高效液相色谱法测定兽药多残留的方法；了解建立高效液相色谱法测定兽药多残留的方法步骤及需要测定的参数。磺胺类药物在紫外区（波长一般在250-280nm）有吸收，可以选择高效液相色谱（配紫外检测器）对上述化合物进行分离，定性定量测定。

实验原理

仪器：岛津高效液相色谱分析仪配有UV100紫外检测器隔膜真空抽滤器（津腾）超声波清洗器电子天平SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵GDYQ-701S样品提取仪101-3型电热鼓风干燥箱PHS-25PH计仪器与试剂磺胺噻唑纯度99.9℅磺胺嘧啶纯度99.9℅磺胺甲基嘧啶纯度99.9℅磺胺二甲嘧啶纯度99.9℅色谱纯甲醇仪器与试剂溶液配制

标准样品溶液配制准确称取四种SAs药物标准品10mg，置于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配置成1mg/ml的标准储备液。混合标准溶液准确称取四种SAs的标准品10mg，共同置于25ml容量瓶中，用甲醇定容，配置成400mg/L的标准储备液。

色谱柱：SymmetryCl8反相色谱柱(4．6×250mmi.d)检测波长：270nm；流动相：甲醇：1%（ψ）乙酸

=25：75进样量：20ul流动相流速:1ml/min色谱条件标准曲线的绘制

由四种样品混合标准液400ppm,进行等度稀释成质量浓度为8ppm、6ppm、4ppm、2ppm、1ppm、0.4ppm的标准系列，各取20ul由高效液相色谱仪进样分析，据峰面积与相应质量浓度进行线性回归，绘制标准曲线。定性实验

将标准样品的四种单品及混合样品溶液分别进行稀释至8ppm，并经HPLC进样分析，根据四种单品各自出峰时间及混合样品中四种单样的出峰时间比较进行定性水样经过0.45um膜过滤后直接进样浓度计算样品的测定其中：C——样品中磺胺类兽药的含量，mgL-1；A——标准曲线的斜率Y——测定样品的峰面积；B——标准曲线的截距；m——称取样品的量，L。液相色谱柱的使用和维护注意事项

样品的前处理最好使用流动相溶解样品。使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动．温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时，阀的转动不能过缓。柱的使用和维护注意事项②应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应从有机溶剂直接改变为水，反之亦然．③一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去柱头的杂质，否则反冲会迅速降低柱效．柱的使用和维护注意事项④选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏．有时可以连接一预柱，分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶＂饱和＂，避免分析柱中的硅胶基质被溶解．⑤避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱．保护柱一般是填有固定相的短柱．保护柱可以而且应该经常更换．柱的使用和维护注意事项⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质，在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，常规分析需要50-75ｍL。柱的使用和维护注意事项正相硅胶柱以正已烷（或庚烷），二氯甲烷（或氯仿）和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，可以省略最后一步用水冲洗。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、水依次冲洗。