2015年生物分子类实验室常用实验技术原理汇总

生物分子类实验室常用实验技术原理汇总

一、GSTpull-down实验2

二、足印法(Footprinting)2

三、染色质免疫共沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)2

四、基因芯片(又称DNA芯片、生物芯片)技术2

五、高效液相色谱(HPLC)3

六、酵母双杂交(Y2H)5

七、噬菌体展示技术8

八、RNA提取(Trizol法)9

九、RT-PCRII

十、实时荧光定量PCR(Q—PCR)(Real-timeQuantitativePCR)11

H-一、BCA法测蛋白质浓度13

十二、大肠杆菌感受态细胞(E.coliDH5a)制备13

十三、碱变性提取质粒DNA14

十四、目的基因的连接、转化及克隆筛选14

十五、RNA干扰(RNAi)16

十六、cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技术17

十七、基因文库和cDNA文库的构建(看课本上的)19

十八、mRNA差异显示技术(DD-PCR)19

十九、抑制差减杂交20

二十、蛋白质芯片21

二H—、Northernblot21

二十二、Southernblot22

二十四、双分子荧光技术26

二十五、酶联免疫吸附测定(ELISA)27

二十六、双向凝胶电泳(2-DE)33

二十七、mRNA的分离与纯化(寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA)33

二十八、His-tag纯化蛋白33

三十、免疫组化34

三十一、各种分子标记技术的比较34

一■、GSTpull-down实验

基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白亲

和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获

蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用

或筛选相应的目的蛋白，''诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、

表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行，操作方便。注：GST即谷胱

甘肽筑基转移酶(glutathioneS-transferase)

二、足印法(Footprinting)

足印法(Footprinting)是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目

的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。其原理

为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase(脱氧核糖核酸酶)分解，

在对目的DNA序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了

解与蛋白质结合部位的核甘酸数目及其核甘酸序列。

三、染色质免疫共沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)

染色质免疫共沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)是研究体内蛋白质

与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还

可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。

染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通

过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白

相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质

免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。

四、基因芯片(又称DNA芯片、生物芯片)技术

基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测

每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微

加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列

固定于2cnT'的硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，被称为基因芯片。

基因芯片主要用于基因检测工作。

基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核

酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核甘酸的探针。当溶液中带有荧

光标记的核酸序列TATGCAATCTAG,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通

过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸

的序列。

一组八核甘酸探针。由杂交位置确定的一组

ATACGTTA.-'

核酸探针序列，

TACGTTAG-

杂交探针组」

重组的互补序列p

TATGCAATCTAG-靶序列，

基因芯片的测序原理

五、高效液相色谱（HPLC）

高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相

改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典

液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物

进行连续检测。

高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，这时整个

系统就被流动相充满。当欲分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱

中进行分离，分离后不同组分依先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来,

得到液相色谱图。

吸附色谱分配色谱离子色谱体积排阻色谱亲和色谱

固定全多孔固体固定液载常在固高效微粒离子具有不同孔径的多孔多种不同性能的配位体键联

相斓捌相基体上交换剂性凝胶在固相基体上

流动不同极性有不同极性有机溶不同PH值的有机溶剂或一定PH值不同PH值的缓冲溶液，可加

相机溶剂剂和水缓冲溶液的缓冲溶液入改性剂

分离可逆性的禽子多孔凝胶的渗透或过具有锁匙结构络合物的可逆

吸附与解吸溶解与挥发

原理交换漉性离解

六、酵母双杂交（Y2H）

酵母双杂交系统的建立

酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认

识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。

80年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的，即这

些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结

合结构域（DNAbindingdomain＞简称为BD）和转录激活结构域

（activationdomain＞简称为AD）,BD可识别DNA_b的特异序

歹（J,并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游；AD可同转录

复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。单独的BD虽然

能和启动子结合，但是不能激活转录。

不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激

活转录的功能（如帝母细胞的Gal4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域

B42融合得到的杂合蛋且仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录）

如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那么GAL4DNA结合结构

域和GAL4激活结构域就会相互作用，从而激活lacZ报道基因的表达。

所以我们可以通过转化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否有相

互作用。

CALICAS|子irZ(orHlSJ)>S«*W

TGALIIASI目成于Itoez<auiaj4凰革因|—

图5-31酵母双杂交体系原理示意图.（a）GAL4的D'A-BD和蛋白质X结合形成的杂

种蛋白，同GAL1的UAS序列结合，但由于没有同AD结合，故不能启动报道基因转

录；（b）GAL的AD同蛋白质Y结合形成的杂种蛋白，没有同【AS序列结合，故不能

启动报道基因转录；（C）通过这两个杂种蛋白中的X蛋白和Y蛋白之间的相互作用，

在细胞内重建了GAL4的功能，结果启动报道基因进行表达.%]P卜'&PC卜

X蛋白与Y蚤白有相互作用X蛋白与Y蛋白无相互作用

酵母双杂交系统通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报

告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为：

1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait),将其与DNA结合域融合，

构建成诱饵质粒。

2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。

3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。

4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，

但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基

因的转录；反之，则不能。利用报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质:

酵母单杂交系统的原理

用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。研

究表明GAL4的DNA结合结构域靠近叛基端，含有几个锌指结构，可激活酵

母半乳糖苜酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构域可与RNA聚合酶或

转录因子TFIID相互作用，提高RNA鬃合酶的活性。在这一过程中，DNA

结合结构域和转录檄活结构域可完全独立地发挥作用。

据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域曾换为其他蛋白，只要他能与

我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活

RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。

酵母三杂交的原理

酵母三杂交系统的原理与酵母双杂交相似，利用了酵母细胞的GAL4

蛋白调节目的基因(半乳糖苦酶基因及His3基因)转录的特点。GAL4蛋白

具有两个可分离的功能区，N端是DNA结合结构域，C端为转录激活结构

域。只要这两个相对独立的结构域能够通过一定的方式在空间上足够的靠

近(如借助其他分子的相互结合使其足够靠近)，即使它们之间没有共价结

合也可激活转录，这为研究蛋白质与其他分子的相互作用提供了可能。

图1解母三杂交系统的原理

七、噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适

当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示

到噬菌体表面的生物技术。

噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白

结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽

或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展

示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽

库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体

或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下

一轮洗脱，经过3轮〜5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度

富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。

噬菌体展示技术

原理

噬菌体展示技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的

噬菌体载体上，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣

壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可

保持相对的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用适当的淘洗

方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶

分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面,而其编

码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出

来。

该技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系.

八、RNA提取（Trizol法）

Trizol试剂中的主要成分为异硫氟酸呱和苯酚，其中异硫氟酸胭可裂解细胞，促使核

蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸

性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍

留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA,有机层（黄色）主要为

DNA和蛋白质。

TRIzol法抽提总RNA

组织10Omg

X

加ImITRIzol

I

匀浆（要彻底，后转至EP管）

（组织匀浆量＞100mg时分装1ml/每EP管）

I

颠倒混匀10下，室温5分钟（30%：孵育）

I

加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）

I

颠倒混匀15S,室温2-5分钟（3（TC孵育）

I

4℃,离心12000g,15分钟

转上层水相（约400A1）于另一1.5mlEP管中

加等体积异丙醇（约400-500uI）,混匀室温10分钟

4℃,离心12000g,10分钟（30%：孵育）

i

弃上清

i

加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml

4℃离心7500g,5分钟

i

弃上清，空气干燥570分钟（不能完全干燥）

I

溶于DEPC水中至20u।（10uI-20uI）

（可在55-60℃水中，＜10分钟助溶）

实验流程图

pH5.7

九、RT-PCR

RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首

先经反转录醐的作用从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR可

以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。

实验步骤：

1、RNA的提取；

2、反转录合成cDNA；

3、PCR扩增；

4、产物的电泳和结果的测定。

十、实时荧光定量PCR(Q—PCR)(Real-timeQuantitativePCR)

利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每•个循环扩增产物量的变化，通过Ct

值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。

阈值：是循环开始3〜15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数

增长期。

C(t)值：荧光信号(扩增产物)到达阈值时所经过的扩增循环次数。

Q-PCR分四个阶段

平台期

线性增长期

指数增长期

基线期

如何定量?

g值

•Ct值的概念

­Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号

开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对

应的循环次数。

H^一、BCA法测蛋白质浓度

K二实验原理

EGA(bicinchoninicacid,二辛可酸)法

舸定蛋白质即在碱性条件下蛋白质与

匕12+络合，并将其还原成Cul+。Cul+和

BCA试剂反应，使其由原来的苹果绿形成

稳定的复合物，在562nm有强

烈的光吸收，且吸光值和蛋白质浓度在

广泛范围内有良好的线性关系，因此可

用于蛋白质浓度测定。

方法灵敏度时间原理干扰物质说明

灵敏度低，适于费时M蛋白凝(可用用于标准蛋白质含

凯氏定氮法

0.2-l.0mg氮，870小凝，用酸吸收后滴三氯乙酸沉淀量的准确测定：干

(Kjedahl法)

误差为±2%时定蛋白质而分离)扰少：费时太长。

中速硫酸筱：测定快速.但不太

双缩服法只敏度低多肽健+缄性Cu2+

20-30分Tris缓冲液：灵敏：不同蛋白旗

(Biuret法)1~20mgT紫色络合物

钟某些女基酸显色相似。

快速蛋白旗中的酪氨酸各种嚓吟和喀用于层析柱流出液

较为灵敏

紫外吸收法5-10分和色额酸残基在喻的检测：核酸的吸

50-1OOpg

钟280nm处的光吸收各种核甘酸收可以校正.

硫酸筱：耗费时间长：操作

慢速双缩肥反应：磷粗

Folin•的试剂法灵敏度高Tris慑冲液：要严格计时：

4a60酸•磷钙酸试剂被

(Lowry法)〜5四甘氨酸:颜色深浅随不同蛋

分钟Tyr和Phc还原

各种硫醇白班变化.

考马斯充道染料与最好的方法：干扰

快速强碱性缓冲液：

考马斯亮蓝法灵敏度最高蛋白质结合时，其物质少；颜色稳定：

5~15分TritonX-100;

(Bradford法)5Hg/.max由465nm变为颜色深浅随不同蛋

钟SDS

595nm白灰变化。.

十二、大肠杆菌感受态细胞(E.coliDH5a)制备

1、前夜接种受体菌(DH5或DH10B),挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜

(约16小时)；

2、取1ml过夜培养物转接于100mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3

小时(250-300rpm)；

3、将0.IMCaClz溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；

4、吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟;

5、4℃下3000g冷冻离心5分钟；

6、弃去上清，加入100微升预冷0.lMCaC12溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细

胞重新悬浮，在冰放置20分钟：

7、4℃下3000g冷冻离心5分钟；

8、弃去上清，加入100微升预冷0.IMCaC12溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使

细胞重新悬浮；

9、细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%-20%甘油）后超低温冷

冻贮存备用（-70℃）。

十三、碱变性提取质粒DNA

碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目

的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒

DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8

的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液

中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分

子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

十四、目的基因的连接、转化及克隆筛选

（1）总过程：

分一-PCR分离目的基因

切一限制性内切酶切割

接-一目的基因与载体相连

转--转入宿主细胞

筛--筛选阳性重组体

（2）分一-PCR分离目的基因：PCR克隆、同源克隆、文库筛选

（3）切--限制性内切酶切割：粘性末端、平末端

（4）接一-目的基因与载体相连

原理：利用DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个或者几个A碱基的

特性和利用T载体3'末端的T碱基和PCR产物的A碱基互补配对，经连接酶作用,完成与载

体的连接。

2.与T载体直接连接

（1）PCR产物两个3,端一般都有一个A

TaqDNA聚合酶的特性：在DNA双

链的3,端再加上一个多余的核甘酸

（优先加A）o

（2）T载体的两个3,端人为地各加一个T

利用TaqDNA聚合酶，当原料中只

有dTTP时，被迫在平端载体上添加

T!

（5）转--转入宿主细胞

感受态细胞：经过电击、CaC12、RuCl等化学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化,

成为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态。

实验流程勿工

（动J

感受态细菌连接产物混匀.429水浴-

।**

lOOul10ul冰浴中30s90s

涂板加入500plLB培养液

4*冰浴1-2min

培养过夜37。（3振荡培养60min

（6）筛--筛选阳性重组体

筛一一筛选阳性重组体

蓝白斑试验（IPTG-Xgal试验）——

原理：

pMD»18-TVector含有编码B-半乳糖昔禽基因（LacZ

基因）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编

码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，

不影响功能.当这种载体转入的宿主细胞是含有B-半

乳糖昔酹津编码序列时，此薰的蝴序列和事序列可

以互补（称为Q互补），产生具有篝活性的蛋白质（B

一半乳糖昔酶），从而使宿主细菌在含有IFIG（强谓导

剂）»X-gal（生色底物）的培养基上呈蓝色.然而外源

DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，破坏原有的阅读

框，因此同样情况下，带重组质粒的细菌形成白色菌落.

十五、RNA干扰（RNAi）

一些小的双链RNA（siRNA）可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内

特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi）。

dsRNA

Dicer

在起始步腮加入的dsRNA被Dicer能切割为

21-23核甘酸长的小分子干扰RNAJ；段

siRNA

2protein

pon*nts

在RNAi效应阶段,siRNA妆钺”，合个核

陆或合物从而出成所谓RNA济导沉默U介物

RNA-lnducedsilencingcomplex,or^5"RISC

RNAiRISC）

机制siRNAunwinding

激活RISC乐要•个ATP依敕的/siRNA解双Activated

模式图键的过程RISC

Associationwfth

targetmRNA

激活的RISC混过【威基配对定位到同源mRNA

转录本上

并在距离siRNA3'端12个碱邛的位置切割

.TargetmRNA

mRNAdeavoge

***">»^»Sense^***««»TargetmRNA

Antisense

RNA干扰研究的一般流程

确定目的基因

根据相对应的核酸序列设计出siRNA的序列

获得siRNA

用siRNA转染细胞

分析RNA干扰的效果

十六、cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNA

ends,RACE)技术

cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技术是一种基于mRNA

反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点，扩增基因转录木的未知区域,

从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长

CDNA5'和CDNA3'末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方

便、高效等优点，可同时获得多个转录本。因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA

文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

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AMMQSP

rtMtod

图25'RACE的原理图

3,RACE-PCR

AAAAAAAA”

L]_RTwrtbAnchor

primer

AAAAAAA

Denature.annMil

intefnol&petmer

图13,RACE的原理图

十七、基因文库和cDNA文库的构建（看课本上的）

十八、mRNA差异显示技术（DD-PCR）

mRNA差异显示技术是将mRNA逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。

每一种细胞（包括同一组织细胞经过不同的处理）都有其特异表达的不同于其他组织细胞的

基因谱（有差异基因表达），即特异的RNA指纹图谱。差异基因表达是细胞分化的基础，正

是这些基因在细胞中的特异表达与否，决定了生命历程中细胞的发育和分化、细胞周期调节、

细胞衰老和凋亡等。mRNADDRT-PCR技术正是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速

而行之有效的方法。其基本原理是从基因背景相同的2个或几个被比较的细胞系或组织中

提取总RNA,逆转录成cDNA,用不同引物对，进行PCR扩增，扩增时加入同位素标记的核

甘酸。利用测序胶电泳技术分离PCR产物，经放射自显影即可找到差异表达的基因。

实验组总RNA提取对照组总RNA提取

II

「2M锚定引物逆转录成cDNA「2M锚定引物逆转录成cDNA

II

随机引物进行PCR扩增随机引物进行PCR扩增

扩增产物凝胶电泳分析

I

差异性条带地回收，二次PCR扩增后克隆入载体

I

序列测定，Genbank查询

I

NorthernBlot和DotBlot杂交确定差异性条带的真实性

I

以差异表达条带为探针从cDNA文库中克隆到全氏cDNA

I

基因功能鉴定

基因敲除真核细胞抗体制备酵母双杂交

表达、转染细胞内定位探讨作用途径

十九、抑制差减杂交

抑制差减杂交技术原理抑制差减杂交技术(SSH)是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR

和DNA差减杂交方法相结合的方法。其依据的主要技术有两点：(1)消减杂交；(2)抑制PCR。

经抑制差减杂交后的cDNA群体不仅富集了差异表达基因(目的基因)，而且目的基因间丰度

的差异经过均等化作用已基本消除，使消减后的cDNA群体为丰度一致的目的基因群体。

抽提两种不同来源组织的mRNA(tester和driver),反转录成cDNA,用4碱基识别酶

(Rsal)或HaelII酶切两种cDNA产生平端片段;将testercDNA分成均等的两份,分别接上

dapterl和adapter2两种接头，并与过量的经Rsal消化的driver样本变性后退火杂交。第

一次杂交后有4种产物:a是单链testercDNA;b是自身退火的testercDNA双链;c是tester

和driver的异源双链；d是drivercDNA。

根据复性动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链

cDNA,因此第一次杂交使得丰度有差别的cDNA的单链分子的相对含量趋向一致。混合两份杂

交样品，同时加入新的变性drivercDNA进行第二次消减杂交。杂交完全后补平末端，加入

合适引物(即adapterl和adapter2的部分特异序列)进行PCR扩增,只有含不同接头的双链

DNA分子(e)才可进行指数扩增，扩增产物即为目的片段。利用adapter上的酶切位点可进行

克隆、测序等。

由RNA合成cDNA

RsaI的切

cDNA接

第_次请减条交

第二5^0^

第一次PCR扩增

第nepCR扩增

宣集差异表达基因

二十、蛋白质芯片

蛋白质芯片，又称蛋白质阵列

或蛋白质微阵列，是指以蛋白质

分子作为配基，将其有序地固定

在固相载体的表面形成微阵列：

用标记了荧光的蛋白质或其他它

分子与之作用，洗去未结合的成

分，经荧光扫描等检测方式测定

芯片上各点的荧光强度，来分析

蛋白之间或蛋白与其它分子之间

的相互作用关系。

二H—、Northernblot

Northernblot印迹杂交原理示意图

二十二、Southernblot

二十三、荧光共振能量转移

1、SYBRGreen法

SYBR

Green

□SYBRGreen只有和双钱DNA结合后才发货光

口变性时，DNA双链分开，无货光

-□在延伸结束阶段采集美光信号。

口SYBRGreen也能和非特异的双链DNA结合发光，所以

必须在反应结束时做壕解曲钱.分析。

SYBRGreenI染料法——作用机理

热变性引物FF受光物质

III⑥卷⑥

IIIIIIIIIIIIIIII

引物退火DNA聚合舞^

TTT

〜・―后,IIIO'.-®®

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延伸反应一

T；：：

F：F：*F*F：F：[yTTII

Taqman探针法工作机理

探针

热变性年1r报告疑居毅甄

IIIIIIIIIIIIIII

引物和探针与模板退火

延伸反应

TaqMan5探针

图4TaqMan探针的荧光信号产生机制

2、TaqMan探针法

TaqMan一水解型杂交探针

RReporter

Probe9,Quencher

与目标序列互补

❖5'181(Reporter.R),如FAM、VIC等

♦：♦3'舄林记有关光评文基团(Quencher,Q)

♦:♦林针克矍，R所发M的美光能受世Q泉团双收，无美无，R与Q分开，发货光

❖Taq薛木5'-*3/外切版酸硅活柱，可夫斛探什

实时荧光定量PCR的分类——分子信标

宝标记荧光的发夹探针

H环与目标序列互补

E茎由互补配对序列组成

实时荧光定量PCR的分类二一分子信标

MolecularBeaconPrinciple

FRET

二十四、双分子荧光技术

四、双分子荧光互补技术(bimolecular

fluorescencecomplementation,BIFC；

BiFC技术是将荧光蛋白(GFP、YFP、DFP)

分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再“别

与目标蛋白连接。如果1、II机主白因为有j］互

作用而接近，就使得荧光蛋)I

空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因和发

出荧光。在‘、下，就能直接观察到第n

标蛋白是否具有相互作用，对研究蛋白质相

用有重要意义。

7双分子荧光互补技术BiFC

双分子荧光互补(bimolecularfluorescence

complementation,BiFC)分析技术,利用绿色荧光

蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)及其突变

体(YFP,CFP,BFP)的特性作为报告基因，将荧光蛋白

分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目

标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠

近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠

近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显

微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作

用，并旦在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其

相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复

合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影

响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。

PrincipleoftheBiFCassay

AbsorptionEmission

C-terminal

YFPfragment

AfterBiFC

二十五、酶联免疫吸附测定(ELISA)

ELISA是一种免疫测定(immunoassay,IA)。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗

体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物

质的量直接相关，山此进行定性或定量分析。

用于临床检验的ELISA主要福义建

几种类型：WW

一双抗体夹心法测盘原’(常婿

•夹心法

双抗原夹心法测抗体

•间接法测抗体(常用)

竞争法测抗原

•竞争法工［

竞争法测抗体

•捕获包被法测抗体

•亲和素•生物素ELISA法

双包被特异性抗体

抗

洗

条

、

/、

体

夹加入待测样品

二

育

✓O洗涤

HD

子

心7T

法

测加酶标特异性抗体

如盲

洗

:条

抗/

原

底物显色

a改体《心仇副士仇儿

间接法测抗体

☆间接法是检测抗体最常用的方法。

☆原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的

受检抗体，故称为间接法。

检抗体覆标记的抗体

+

◊会同相抗原为厂

）加底物

7显色

间接法测定抗体示意图

血

清

1.包被抗原稀

释

度

2.洗涤

2

3.加待检抗体4

8

4.洗涤

168

32

5.