乳杆菌发酵生产工艺研究

乳杆菌发酵生产工艺研究

重组干酪乳杆菌是一种活载体口服疫苗候选菌株，并兼有乳酸菌的益生功能，而且在体内能够发挥很多生理效应。传统的干酪乳杆菌放大培育用MRS培育基进展，细菌数量和表达量较高，但MRS培育基的价格比拟贵，本钱较高，口感欠佳，所以人们将目光放在价格低廉，养分丰富，口感香甜的乳清蛋白上。乳清蛋白是从巴氏杀菌的乳清中去除非蛋白并经过过滤沉淀制成的。乳清蛋白口感好，养分丰富，易消化汲取。将二者的优势结合起来以求研制出兼具预防和养分功能畜用口服液制剂。讨论旨在将二者优势结合起来以求研制出一种兼具预防和养分功能的畜用口服液制剂。试验选用乳清浓缩蛋白80为原料，讨论其生产工艺最正确参数，制备有利于重组菌存活的液体制剂，为进一步制备预防仔猪腹泻口服液疫苗奠定根底。

1材料

1.1质粒和菌株TGEV-BC重组干酪乳杆菌有试验构建并保存；干酪乳杆菌CICC6105（LactobacilluscaseiCICC6106）购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2主要试剂琼脂糖购置自Spanish公司产品；氯霉素购自Sigma公司；YeastExtract购自OXOID公司；其他生化试剂为国产分析纯产品。

2方法

2.1口服液疫苗生产工艺流程菌种活化→菌种鉴定→转接入乳清蛋白培育基→生产工艺参数优化

2.2重组菌的活化挑取培育好的MRS琼脂平板上的单菌落，接入10mLMRS液体培育基中，37℃静止培育16h，然后按2%接种量接入100mL的MRS液体培育基中进展扩大培育，37℃静止培育16h，备用。

2.3TGEV-BC重组干酪乳杆菌PCR的鉴定随机挑取MRS培育基上生长的单菌落，接种于含氯霉素（34μgmL-1）的MRS液体培育基中，37℃静止培育过夜。根据DanielJ等供应的方法提取质粒，方法如下：（1）取过夜培育的菌液2mL于离心管中，12023rpm离心1min收集菌体沉淀；（2）参加含有25%蔗糖和30mgmL-1溶菌酶的溶液200μL重悬沉淀，混合匀称后，37℃水浴20min；（3）向溶液中参加含3%SDS和0.2N的NaOH的裂解液400μL，快速混合匀称，室温放置7min；（4）在向其中参加预冷的3M醋酸钠300μL，4℃、12023rpm离心15min；（5）将上清液移到一个新的离心管中，参加650μL的异丙醇后，4℃、12023rmin-1离心15min；（6）弃去上清，参加1mL75%的乙醇洗涤沉淀，4℃、12023rpm离心5min，重复洗涤两次；（7）倾倒上清，向其中参加30μL的含有Rnase酶的TE悬浮沉淀，-20℃保存备用。用提取好的质粒作为PCR模板进展PCR鉴定，同时设置空菌作为对比组。用1%的琼脂糖凝胶电泳进展鉴定。

2.4发酵生产工艺参数优化

2.4.1乳清蛋白浓度对活菌数的影响将活化好的重组菌菌株，按2%的接种量分别接种于浓度为2%、4%、6%、8%、10%、12%和14%的150mL乳清蛋白培育基中（起始pH7.0），厌氧条件下37℃静止培育16h后分别取样，涂平板计数。

2.4.2重组干酪乳杆菌发酵时间对活菌数的影响将重组菌TGEV-BC/L.casei过夜培育，次日按2%接种于MRS液体培育基中连续培育，每2小时取样一次，测其OD值，绘制乳酸菌的生长曲线。

2.4.3培育方式对重组菌活菌数影响的结果将活化好的菌株，采纳间接接种方式按2%接种量分别接种于150mL浓度为2%的乳清蛋白培育基中（pH6.6）。由于乳酸菌是厌氧微好氧菌，所以采纳以下4种培育方式进展试验，即静置培育、80rmin-1振荡培育、100rmin-1振荡培育、120rmin-1振荡培育，厌氧条件下37℃培育16h后分别取样，涂平板计数。

2.4.4半连续高密度探究采纳培育至对数后期的培育液进展补充新奇培育基的方式，换液后培育1.5～2.0h，重复进展3次操作，每次测定活菌数。

2.4.52L摇瓶放大培育采纳优化工艺参数，用2L摇瓶放大培育，培育完毕后取样，检测基因工程重组菌的表达状况并计算活菌数。

3结果

3.1TGEV-BC重组干酪乳杆菌PCR的鉴定的结果以TGEV-BC重组干酪乳杆菌为模板，通过设计的特异性引物进展PCR扩展，扩展产物经1%的琼脂糖凝胶电泳进展分析，可见1349bp的特异性条带，与预期DN段大小全都。

3.2乳清蛋白浓度对重组菌活菌数的影响浓度分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%乳清蛋白培育基对重组菌活菌数的影响见图1，从图中可知，随着乳清蛋白浓度的增加，重组菌的活菌数也在随之增加，但当乳清蛋白浓度到达10%时，活菌数的数量到达最高。而后再进一步提高乳清蛋白浓度，活菌数的数量不但没有上升，反而呈现下降趋势，这说明过高的浓度并不利于重组菌的生长。因此，确定乳清蛋白的最正确浓度为10%。

3.3重组干酪乳杆菌发酵时间对活菌数的影响如图3所示，酸菌延至期细菌代谢活泼，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP以及其他细胞成分。细胞往往不生长生殖，其数目无明显增加。为后面做预备；乳酸菌进入对数生长数期，细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比拟稳定，开头快速生殖，进入稳定期后，有害代谢产物积存，新增细胞数目与死亡细胞数目到达动态平衡，次级代谢产物大量积存，形成芽孢，细菌种内斗争最剧烈，生殖速率渐渐下降；进入衰亡期，细菌数目急剧下降，消失畸形细菌，养分耗尽，大量死亡。因此乳酸菌的最正确发酵时间为稳定期的中后期，所以发酵时间为16h。

3.4培育方式对重组菌活菌数影响的结果随着摇床转速的增加，当摇床转速80rmin-1时，培育基中重组菌活菌数最高。当摇床转速为120rmin-1时，培育基中重组菌活菌数略有下降低，氧气的增加对重组菌的生长有抑制作用。因此，最正确的培育方式为采纳80rmin-1震荡培育，见图4。

3.5半连续培育结果如图5所示，乳酸菌发酵过程中，乳酸等次级代谢产物大量积存，抑制乳酸菌的增值，补料后实现连续带放、既可补充养分物质又调整pH，使得发酵指数得以大幅度提高，与一般发酵相比，活菌数提高了一个数量级。

3.6摇瓶培育的活菌数和基因表达结果采纳优化后的生产工艺参数，即乳清蛋白培育基的浓度为4%、发酵时间16h、转速80rmin-1震荡培育、半连续培育，进展3次重复试验得到重组菌活菌数的平均实测值为7.3×109cfumL-1。

4争论

基因工程菌是利用基因工程技术，将外源目的基因导入宿主细胞使其表达所需蛋白的重组菌。基因工程菌发酵是为了获得大量的外源基因表达产物，与发酵生产工艺的掌握有特别重要的关系。试验利用廉价乳清浓缩蛋白对TGEV-BC重组干酪乳杆菌口服液的生产工艺进展讨论，通过单因素试验，讨论了乳清蛋白浓度、乳酸菌发酵时间、培育方式以及半连续培育对基因工程重组菌生长的影响。

基因工程菌的发酵是为了到达高密度培育，高密度培育需要高浓度的养分物质，才能保证菌体快速生长及大量表达目标蛋白。但过高的浓度反而会抑制菌体生长和目标蛋白的表达。在试验中，随着乳清蛋白浓度的提高，重组干酪乳杆菌活菌数渐渐上升，在乳清蛋白浓度为10%的时候活菌数到达最高。当乳清蛋白浓度超过这一范围时，菌体的生长受到了抑制，数量开头下降，因此乳清蛋白浓度选择10%为最正确培育浓度。乳酸菌发酵时间的掌握是影响活菌数变化的重要因素。稳定期时有害代谢产物积存，新增细胞数目与死亡细胞数目到达动态平衡，次级代谢产物大量积存，形成芽孢，细菌种内斗争最剧烈，活菌数到达最大值，稳定期是以生产菌体为目的的发酵生产的最正确收获期。因此最正确发酵时间为16h，此时活菌数最高。采纳高密度发酵的工程菌，其溶氧浓度的凹凸也会影响培育基中的氧化复原电势，从而使菌体的代谢途径发生转变，影响菌体生长，进而影响外源蛋白表达的产量。通过搅拌、震荡方式可以掌握溶解氧的浓度。在试验中，摇床转速选择为80rmin-1有利于菌体生长。

乳酸