【】生化实验思考题参考答案

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生化试验讲义思量题参考答案

试验一淀粉的提取和水解

1、试验材料的挑选依据是什么？

答：生化试验的材料挑选原则是含量高、来源丰盛、制备工艺容易、成本低。从科研工作的角度选材，还应该注重详细的状况，如植物的时节性、地理位置和生长环境等，动物材料要注重其年龄、性别、养分情况、遗传素养和生理状态等，微生物材料要注重菌种的代数和培养基成分的差异等。

2、材料的破裂办法有哪些？

答：(1)机械的办法：包括研磨法、组织捣碎法；

(2)物理法：包括冻融法、超声波处理法、压榨法、冷然交替法等；

(3)化学与生物化学办法：包括溶胀法、酶解法、有机溶剂处理法等。

试验二总糖与复原糖的测定

1、碱性铜试剂法测定复原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定办法各有何优缺点？

答:我们采纳的是碱性铜试剂法中的间接法测定复原糖的含量。间接法的优点是操作简便、反应条件温柔，缺点是在生成单质碘和转移反应产物的过程中简单引入误差；直接法的优点是反应原理直观易懂，缺点是操作较复杂，条件强烈，不易控制。

试验五粗脂肪的定量测定─索氏提取法

（1）本试验制备得到的是粗脂肪，若要制备单一组分的脂类成分，可用什么办法进一步处理？

答：硅胶柱层析，高效液相色谱，气相色谱等。

（2）本试验样品制备时烘干为什么要避开过热?

答：防止脂质被氧化。

试验六蛋白质等电点测定

1、在分别蛋白质的时候，等电点有何实际应用价值？

答:在等电点时，蛋白质分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增强，所以处于等电点的蛋白质最简单沉淀。在分别蛋白质的时候，可以按照待分别的蛋白质的等电点，有目的地调整溶液的pH使该蛋白质沉淀下来，从而与其他处于溶液状态的杂质蛋白质分别。

试验七氨基酸的分别鉴定－纸层析法

1、如何用纸层析对氨基酸举行定性和定量的测定？

答:将标准的已知氨基酸与待测的未知氨基酸在同一张层析纸上举行纸层析，显色后按照斑点的Rf值，就可以对氨基酸举行初步的定性，由于同一个物质在同一条件下有相同的Rf值；将点样的未知氨基酸溶液和标准氨基酸溶液的体积恒定，按照显色后的氨基酸斑点的面积与点样的氨基酸质量成正比的原理，通过计算斑点的面积可以对氨基酸溶液举行定量测定。

3、纸层析、柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？

答:

(1)简述紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理及优点。

答：原理：因为蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有汲取紫外线的性质，汲取高峰在280nm波特长。在此波长范围内，蛋白质溶液的光汲取值（OD280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。优点：快速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

试验十影响酶活性的因素

（1）本试验中如何通过淀粉液加碘后的色彩的变化来推断酶促反应快慢的？

答：在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，经过一系列被称为糊精的中间产物，最后生成麦芽糖和葡萄糖。变化过程如下：淀粉→紫色糊精→红色糊精→麦牙糖、葡萄糖淀粉、紫色糊精、红色糊精遇碘后分离呈蓝色、紫色与红色。麦芽糖和葡萄糖遇碘不变色。因此反应后色彩如为蓝色说明酶活力低，淡黄色则说明酶活力高。

（2）如何通过加入班氏试剂后生成沉淀多少来反映酶促反应快慢的？

答：淀粉与糊精无复原性，或复原性很弱，对本尼迪克特试剂呈阴性反应。麦芽糖、葡萄糖

是复原糖，与本尼迪克特试剂共热后生成红棕色氧化亚铜的沉淀。因此，产生红棕色氧化亚铜的沉淀越多说明酶活力越高。

（3）通过本试验，结合理论课的学习，小结出哪些因素影响唾液淀粉酶活性？是如何影响的？

答：温度、pH、激活剂、抑制剂等。高于或低于最适温度或pH，酶活力都会降低；激活剂和抑制剂不是肯定的，只是相对而言，随着浓度的变化而变化。

试验十二碱性磷酸酶的分别提取及比活力的测定

(1)试说明用硫酸铵分级分别酶的办法及应注重的大事。

答：用盐分级沉淀是一种应用十分广泛的办法。因为硫酸铵在水中溶解度很大（，每升可溶），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。例如：某酶（或蛋白质）发生盐析的范围为35-65%饱和硫酸铵的浓度，因此可先挑选30%饱和硫酸铵浓度，去沉淀杂蛋白，然后挑选70%饱和硫浓度酸铵，留沉淀（含所要的酶）。

注重事项：在用硫酸铵沉淀酶蛋白时，要注重缓冲液的pH值和温度，盐的溶解度随温度不同而有较大的变化，同时酶的溶解度亦随温度的转变而转变。在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加入过程需缓慢并准时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。

(2)用正丁醇处理匀浆液可以有效地使碱性磷酸酶酶蛋白释放，使酶的产量大大提高，这是

为什么？

答：由于碱性磷酸酶酶是一种膜蛋白，正丁醇处理后可使结合在膜上的蛋白质更多地释放出来。

(3)酶活力测定时，为什么必须先将酶液对缓冲液透析后才测定？

答：去除盐离子的影响。

试验十三凝胶过滤层析纯化碱性磷酸酶

1.在本试验中要注重哪些重要环节？

答：

1）注重区别柱子的上下端。

2）各接头不能漏气，衔接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。

3）装柱要匀称，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避开因此凝胶。

4）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝

胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流淌。

5）核酸蛋白检测仪，记录仪，部分收集器要正确衔接。

6）要控制一定流速。

7）收集得到的液体要举行酶活力的检测。

试验十四底物浓度对酶活力的影响（米氏常数的测定）

1.在测定酶催化反应的米氏常数Km和最大反应速度Vm时，应如何挑选底物浓度范围？答：底物浓度挑选范围[S]0.2-5.0Km为宜。底物浓度选取还应当注重其倒数能匀称分布。

1/v1/v

01/[S]01/[S]

底物浓度太大底物浓度太小

2.试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。

答：(1)Km是酶的一个极重要的动力学特征常数，Km物理含义：ES络合物消逝速度常数与形成速度常数之比；其数值相当于酶活性部位的一半被底物占领时所需的底物浓度。

(2)可按照Km估量底物浓度的水平。

(3)Km可作为同工酶的推断依据。

(4)鉴别最适底物。

(5)有助于在酶学讨论中对底物浓度的挑选。选用[S]>10Km浓度举行活力测定

3.为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？

答：某种酶的Km在给定的体系中不随酶浓度转变而转变，也与酶的纯度无关，因此是酶的一个特征常数。但Vm随酶浓度转变而转变。

试验十七SDS电泳

(1)简述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量的原理;

答：1）SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质–SDS复合物。

2）SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，消退或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使SDS与蛋白质的复合物都带上相同密度的负电荷。

3）SDS-蛋白质复合物在水溶液中的外形一样，都是近似于雪茄烟形的长椭圆棒。

4）不同的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，并具有相同外形；因此在一定浓度的凝胶中，因为分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数。

(2)是否全部的蛋白质用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳办法测定得到的分子量都彻低牢靠？

答：不是。

如电荷异样或构象异样的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。

例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能彻低掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。

试验十八维生素C的定量测定

（1）简述本法测定VC的利与弊。

答：碘量法测定VC相比其它办法传统的碘滴定法快速、简捷，但易受到待测物色彩干扰而不易推断滴定尽头；只能测定待测溶液还原型的Vc含量，假如溶液中还含有其他还原型较强的物质会影响测定结果；而且待测的还原型Vc易被空气氧化影响滴定结果。

（2）为何以显蓝色在