毛细管电泳仪应用於中药成分之定量

毛細管電泳儀應用於中藥成分之分析定量行政院衛生署藥物食品檢驗局顧祐瑞博士一前言中藥為我國重要的文化資產之一，原本就值得推廣與重視，近年來國內許多大企業投入大筆經費，致力於中藥新藥之研發。由於中藥材之成分複雜，且常因基原、產地、採收季節、炮製、儲存等種種因素，致使其成分有相當大的差異，進而影響中藥材的品質。因此，有關中藥成分之分析及品質之管制，變得相當的重要。行政院衛生署為了提昇中藥濃縮製劑的品質，已於八十九年七月二十四日公告，自九十年一月一日起，凡申請葛根湯等十種中藥方劑之濃縮製劑，查驗登記新案及藥品許可證有效期間展延時，應制訂指標成分定量方法。美國藥物食品管理局(FDA)亦於八十九年八月公佈，「GuidanceforIndustry(Draft)BotanicalDrugProducts」(美國FDA植物性藥物產品規範草案)，提出中草藥新藥研發，需以CMC(即化學、製造、品質)加以管制。目前中藥成分之分析定量，以高效液相層析(HPLC)最普遍，然而HPLC分析時存在著若干變數及困難，例如通常分析時間長，且分析完成後管柱之清洗時間亦甚長；更換溶媒、管柱，清洗管柱需要時間，致使儀器自動化限制多；成分易殘留於管柱內，清洗不易，使用之緩衝溶液等添加劑，則易損害管柱內之填充物；管柱及溶劑費用高，尤其會產生大量含有有毒溶劑(如乙月青、二氯甲烷)之廢液。毛細管電泳(Capillaryelectrophoresis或Highperformancecapillaryelectrophoresis)，簡稱CE或HPCE，是最近十年來蓬勃發展的分析方法，電泳是電介質中帶電粒子在電場作用下，以不同速度向電荷相反的電極方向移動的現象，利用這種現象對某些化學成分進行分析的技術。毛細管電泳的發展，在1967年Hjerten等率先提出在高電場，直徑3mm毛細管中作自由溶液的毛細管區帶電泳(Capillaryzoneelectrophoresis)，簡稱為CZE；1984年Terabe等建立一種重要的分離模式，即以各組成分(特別是中性成分)，在毛細管內的膠束(Micelle)及緩衝溶液之間的分配為基礎之膠束電動力學毛細管層析(Micellarelectrokineticcapillarychromatography)，簡稱為MECC或MEKC；1990年Honda等最早將毛細管電泳應用於芍藥中Paeoniflorin及Oxypaeoniflorin之定量，發現毛細管電泳之再現性佳，定量結果與HPLC相似。毛細管電泳的種種方法中以上述CZE及MEKC最常用，其中CZE是毛細管電泳中最簡單的一種方法，毛細管內只充入緩衝溶液，分析之成分以不同的速率在分立的區帶內進行遷移，正、負離子化合物即可分離，而中性化合物在電場中則不會移動。MEKC是毛細管電泳中應用最廣的方法之一，既能分離中性成分，也能分離帶電成分，MEKC主要是在緩衝溶液中，加入一定濃度以上的界面活性劑，以形成膠束，其應用範圍包括維生素、大部分藥物及中藥成分。本文所舉之天麻及玄參兩個例子，皆為MEKC方法，且均以膽酸鈉作為界面活性劑，分析二種藥材中之不帶電荷高極性成分。毛細管電泳之分析方法，係利用不同樣品離子電荷泳動速度的差異，配合毛細管內電解質在外加高電場下所產生的電滲流，形成各種樣品離子在毛細管中淨移動速度不同，因而達到分離效果。與傳統的平板電泳或高效液相層析比較，毛細管電泳的分離效率極高，理論板數常在105~107左右。另外，毛細管口徑小，散熱效果佳，因此可使用高電場進行電泳，大幅縮短樣品分離時間。毛細管電泳與高效液相層析皆屬液相分離技術，兩者之分離機制不同，各有其應用的價值，惟就分離效率、分析速度、成本花費及樣品用量而言，毛細管電泳之理論板數較高，分析速度更快，幾乎不消耗溶劑，而樣品用量僅高效液相層析的數百分之一。毛細管電泳只要針對不同的分子性質(如分子大小、電荷數、疏水性等)改變操作模式和緩衝溶液的成分，便可分離不同的樣品。相較之下毛細管電泳具有更大的選擇性，欲分析不同的樣品亦不需更換價格昂貴的管柱。毛細管電泳與高效液相層析之比較整理如下：碰毛細膀管電主泳室高效渴液相饿層析膏分析塔速度姑較快挖較慢史理論票板數仇較高据較低呈溶媒死消耗锯無或虑少边多望樣品纤量通低叔(赵以承nl韵計念)贫高转(μ驳l崖計糠)库管柱愚價格酬低钱高四管柱颤清洗洲快、镇容易晋費時罪自動杜化思高团不容兽易二‧毛細管電泳應用(一)麻藥材中Parishin、ParishinB及ParishinC之含量測定：天麻，原名赤箭，別名明天麻，係蘭科(Orchidaceae)植物天麻Gastrodiaelata的乾燥根莖。Parishin(tris[4-(β-D-glucopyranosyloxy)benzyl]citrate)、ParishinB及ParishinC(1,2-及1,3-bis[4-(β-D-glucopyranosyloxy)benzyl]citrate)為自天麻分離得到之三種高極性成分，分別為帶有三個及二個葡萄糖之檸檬酸鹽，筆者建立了三種成分之毛細管電泳與高效液相層析之分析方法，其條件如下：1.高效液相層析之條件：高效液相層析儀：Hitachi廠牌HPLCL-6200pump連接Hitachi廠牌L-3000Photodiodearray檢測器及Shimazu廠牌SIL-9A自動注射器。分析柱：Cosmosil5C18-AR，5μm，內徑4.6mmI.D.×150mm。檢測波長：UV222nm。移動相：A：甲醇。B：0.1%磷酸溶液。時間(分)AB線性梯度條件01585152575303070403070仿流速箱：1烧.0垦mL疯/m民in将。捡內部度標準胶品：虚Su怕lf条am拐et艺ho疾xy三py校ri罗da忽zi伙ne韵。叛2.除毛侄細管的電泳吊層析寨之條狸件：稳荷毛細怀管電僻泳儀敏：B百ec糠km尤an重廠牌报P/皆AC网E挽55僻00慧。盲毛細拼管：症Be雨ck殖ma桃n鬼內徑铁75催mm州×6慢7c璃m誉un迹co节at慢ed菠c铸ap土il眠la扩ry葡。栽檢測刷波長呆：U猴V遗22创2n絮m。个醉緩衝捏液：勾20咬mM投S扶od瞒iu悲m中te寒tr海ab国or燥at蕉e及粉20检mM碗S与od焰iu惨m边di彼hy存dr涝og倦en鼻ph垦os钢ph建at钳e調仁配為首pH吴6.屑5含挣10暗0m校M墓So捕di侧um说c傅ho填la奋te沙之溶娃液。摔婶溫度部：3峰0℃松。藏電壓乡：1旗5K腊V。抢芳內部愈標準翼品：耗Me宪th晶yl虚pa哄ra技be桨n。敲肺响天麻鬼三種两成分冶之毛扎細管牧電泳梳分析逃，緩创衝液尘用归pH饰6.牢5四复硼酸笨鈉及味磷酸碗二氫凭鈉，竿加入破膽酸鉴鈉作焰界面聪活性拔劑，远其圖述譜如杰圖一皱所示遮，可壳在十帽七分占鐘內组完成监，並吃且有报很好夕的回支收率涂(9衰4.赢8~摔10秀0.磨5%腥)及猴再現吓性(回同日松內之武相對胆標準血偏差弯為1磨.2缴3~脏2.脸80困%；纯異日验間之寸相對掏標準该偏差妹為1考.7额2~抢3.玻24拳%)勾，高谊效液佩相層恨析分凡析時起間較携長，研如圖难二所素示，度為毛也細管刺電泳担之二贤倍。递比較锹二種凶方法烛之再冈現性掌(如状表一捷)，卷毛細寻管電粉泳無绕論在提三次偿分析润成分相時間码或含华量測适定之润相對谁標準休偏差仗，其络結果脆均在习2%屈以下与，與膀高效崖液相睬層析烛相當旷。以守二種曲方法葬定量限分析络四件眠市售夹天麻跃藥材杰，其洗結果胸相差埋不多如(盟如表毁二所掩示)段。浸表一伏天库麻藥迈材中郊指標币成分弦分別车以高捉效液债相層锁析及筐毛細匙管電命泳分灶離之岸再現挂性比诱較指標成分

高效液相層析

毛細管電泳

相對標準偏差(%,n=3)

相對標準偏差(%,n=3)

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砍(m滑g/垮g)散高效感液相哪層析

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贯1陷2.慰17梦2.嘱25称2障2.挥17俩2.集08兽3针1.冈38帐1.咐37牧4效1.宪25晕1.寨30燃檢測封波長煤：U郊V艘27廊8n除m。锤移動情相：堆A：占乙月什青鸭B：汗1.突0%结醋酸俩溶液资。時間(分)AB線性梯度條件01585442773勺流速端：1宫.0接mL跪/m处in芽。蛾內部震標準昏品：盐So烂rb讨ic誓a轮ci跟d。佩纵2.晨毛細题管電遗泳層久析之导條件睛：桥毛細缘管電华泳儀料：與晶天麻薯相同友。鱼毛細够管：蛋Be贯ck腿ma始n情內徑卖75辨mm碎×6侵7c清m孩un跑co折at马ed挂c剃ap女il劣la索ry营。让表三晴玄挥參藥到材中矮指標满成分叹分別鼠以高童效液膨相層劲析及梢毛細抬管電持泳分屡離之僻再現补性指標成分

高效液相層析

毛細管電泳

相對標準偏差(%,n=3)

相對標準偏差(%,n=3)

滯留時間含量測定遷移時間含量測定SN-A0.061.000.221.11SN-B0.011.720.282.80SN-C0.041.720.211.22系檢測矮波長坑：U朵V怠28陆0n辛m。庄湖緩衝叼液：假20苦mM应S暗od否iu甲m善te题tr盾ab郊or观at么e及抵20驴mM区S逃od投iu男m梁di民hy深dr避og数en瑞ph射os名ph关at印e調健配為彼pH书7.伐5含仰12稼0m清M圾So寄di闹um陶c臭ho滩la券te刷及1更2%颜甲醇身之溶绕液。缠溫度劣：2乌5℃由。止電壓驾：2爆5k分V。面內部荣標準互品：饮Pr截op堂yl减pa国ra僚be逢n。企酷能玄參肚三種盒成分萄之毛临細管疯電泳抚分析陷，緩天衝液树用叨pH啦7.办5四魄硼酸押鈉及择磷酸尾二氫批鈉，暖加入蔽膽酸搬鈉作餐界面刘活性劳劑、遭甲醇葛作修戒飾劑挠，其口圖譜割如圖拌三所船示，眉可在夜十九义分鐘盛內完赴成，慎也有渔很好巷的回寺收率楼(1巨02案.4稍~阀1忍03愁.5沙%)宫及再虾現性钢(同糊日內如之相玩對標黄準偏劈差為后0毙.5抄5额~1苹.7津1%方；異巩日間塑之相芦對標知準偏等差為圆1.督36葡~辅3窝.8边3%众)，请高效吗液相夜層析饶分析镰時間刘較長裁，如语圖四解所示革，亦俯為毛葵細管维電泳蛮之二妨倍。纺比較排二種拼方法牢之再更現性止(如械表三筐)，寿毛細午管電尿泳在玉三次孔分析叨成分侍時間漆，其逗結果糖均在北0.亭3%冻以下虾，含况量測宾定之佣相對素標準盐偏差梁，其精結果汇均在返3.被0%跳以下读，與踩高效回液相疾層析艰相當甩。以吨二種产方法陕定量盟分析紫七件浮市售挎玄參述藥材对，其资結果肺亦相盒差不公多(参如表常四所燕示)岔。价三呆‧烘結語东往毛細抗管電瞧泳具秘有高羽選擇舒性、初分析钻時間帽短、桂管柱辱清洗微時間乘短、付再現熔性佳翠、可丈自動袜化等膛特性器，適须合用市於大洁量品别管分冒析之赏用。宾由上凤述所脂舉例返之二熔個研词究觀叠之，须毛細劫管電驱泳可著用於苏中藥直成分牌之分碍析，座其回屡收率杯及再另現性舍均不加亞於恩高效浇液相热層析巡，運乞用毛心細管峡電泳获從事罢中藥炸成分能之分属析確染屬可疾行。魂表四腹七件西市售淹玄參铸藥材温分別障以高押效液察相層品析及播毛細慢管電可泳定婶量之热結果指標成分市售藥材毛細管電泳

(mg/g)HPLC

(mg/g)SN-A11.701.7922.092.0031.971.9141.121.0651.671.6360.700.6571.451.45SN-B10.450.4620.600.6031.461.4241.221.2251.441.4160.330.3470.670.70SN-C10.160.1620.320.3230.110.1140.280.2950.270.2760.070.0770.270.28市圖二盒天麻稳之高胃效液第相層勾析分柔析圖充譜。盯1骗：步Pa服ri洽sh慰in炉B畏；孔2董：敢Pa懒ri宏sh吃in栋C瓣；末3轿：巡Pa废ri参sh衔in纲。近IS幕：內夏部標寒準品敢(S开ul厘fa旺me距th刃ox廉yp列yr委id淡az劫in祥e)握圖一毛天间麻之汤毛細精管電统泳分今析圖毫譜。世1：哥Pa跟ri丢sh割in吵B咽；栏2：扎Pa削ri户sh雹in虎C袄；炕3：捡Pa槽ri内sh哭in赢。聚IS惊：內价部標右準品瓶(M香et虚hy王lp复ar栽ab分en象)。荡圖三恨玄參贝之毛客細管捡電泳屑分析杠圖譜供。径IS右：內贞部標主準品施(P耽ro别py歉lp卸ar花ab研en垃)嘉。严圖四阀玄參济之高呆效液殊相層扁析分城析圖搜譜。购IS究：內绿部標务準品升(S翠or决bi捷c损ac导id牲)浩。拢參考谈文獻吸1.朽Be惩al翻e队SC栏.,挂1柜99椒8,纷C狠ap乞il苹la帅ry接e裹le铅ct距ro缎ph枪or隶es恼is纱.祸A锄na浩lt余ic渣al兵C拖he保mi男st旁ry呼7腥0:答2鸣79基R-饺30鹿0R六.肃2.岛Mc疏L患au鞭gh弟li矩n扭GM严,聚No消la嘉n败JA清,杠Li悄nd钥ah园l件JL竿,凑Pa颠lm忆ie决ri冠R滔H,刺A杨nd弱er骂so辞n量KW鞭,昆Mo沉rr予is朱S描C,颗M颜or号ri促so坏n着JA率a湖nd慕B嚷ro疫nz表er伯t摘TJ捧.,纱1峡99唯2,柜P露ha兔rm摘ac别eu捉ti得ca城l浩dr忽ug渠s疗ep粘ar惨at器io情ns伍b寒y黑HP折CE掉:狐Pr决ac端ti策ca烈l锅gu店id嗽el浑in池es鹿.