基因芯片简介

基因芯片简介随着人类基因组（测序）计划（Humangenomeproject）的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而,怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。基因芯片（又称DNA芯片、生物芯片）技术就是顺应这一科学发展要求的产物，它的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。早在八十年代，BainsW.等人就将短的DNA片断固定到支持物上，借助杂交方式进行序列测定。但基因芯片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。正如电子管电路向晶体管电路和集成电路发展是所经历的那样，核酸杂交技术的集成化也已经和正在使分子生物学技术发生着一场革命。现在全世界已有十多家公司专门从事基因芯片的研究和开发工作，且已有较为成型的产品和设备问世。主要代表为美国Affymetrix公司。该公司聚集有多位计算机、数学和分子生物学专家，其每年的研究经费在一千万美元以上，且已历时六七年之久，拥有多项专例。产品即将或已有部分投放市场，产生的社会效益和经济效益令人瞻目。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（SouthernBlotting和NorthernBlotting等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。基因芯片的原理基因芯片(genechip)的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，可以用图11-5-1来说明。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1）固定在聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列,与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。它是在基因探针的基础上研制出的，所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。由于尚未形成主流技术，生物芯片的形式非常多，以基质材料分，有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等；以所检测的生物信号种类分，有核酸、蛋白质、生物组织碎片甚至完整的活细胞；按工作原理分类，有杂交型、合成型、连接型、亲和识别型等。由于生物芯片概念是随着人类基因组的发展一起建立起来的，所以至今为止生物信号平行分析最成功的形式是以一种尼龙膜为基质的“cDNA阵列”，用于检测生物样品中基因表达谱的改变。基因芯片的主要类型目前已有多种方法可以将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。这些方法总体上有两种，即原位合成（insitusynthesis）与合成点样两种。支持物有多种如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但需经特殊处理。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定的分子为核酸或寡肽而定）并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等。原位合成法主要为光引导聚合技术（Light-directedsynthesis），它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术（photolithography）与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽阵列提供了一条快捷的途径。以合成寡核苷酸探针为例，该技术主要步骤为：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。每次选取择适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。例如，合成48（65536）个探针的8聚体寡核苷酸序列仅需4×8=32步操作，8小时就可以完成。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到106/cm2。不过，尽管该方法看来比较简单，实际上并非如此。主要原因是，合成反应每步产率比较低，不到95%。而通常固相合成反应每步的产率在99%以上。因此，探针的长度受到了限制。而且由于每步去保护不很彻底，致使杂交信号比较模糊，信噪比降低。为此有人将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率增加到98%。原因是光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，当照度达到特定的阈值以上保护剂就会解离。所以，该方法同时也解决了由于蔽光膜透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题，有效地提高了聚合点阵的密度。另据报导，利用波长更短的物质波如电子射线去除保护可使点阵密度达到1010/cm2。投哪除了柜光引蚀导原角位合纽成技妇术外贿，有惰的公尾司如水美国捉I融nc锅yt早e费Ph陡ar思ma个ce判ut妨ic旋al票s远等使换用压肿电打讽印法奉(停Pi尾ez周oe盛le剑ct务ri玻c喊pr纠in揭ti竟ng绍)嘉进行两原位锣合成桥。其植装置偏与普塑通的帽彩色把喷墨敢打印粪机并筐无两瑞样，皆所用汽技术涨也是辛常规茫的固判相合个成方深法。民做法裕是将偶墨盒愁中的傍墨汁启分别雹用四特种碱秆基合劲成试命剂所宏替代蓄，支寇持物套经过享包被辨后，窄通过蓬计算府机控慢制喷承墨打统印机乡将特岛定种庭类的蛛试剂额喷洒乏到预全定的弦区域则上。历冲洗启、去请保护善、偶言联等耗则同拾于一恶般的良固相添原位烛合成押技术缘。如叹此类秆推，妥可以秃合成晨出长某度为跟4春0毛到化50揉个展碱基爆的探甚针，位每步跨产率仿也较贤前述叉方法爹为高材，可征达到克9王9%缎以处上。姓极弯尽管开如此户，通鹊常原拆位合刑成方迹法仍址然比愚较复劝杂，皮除了罪在基召因芯边片研砖究方付面享请有盛遮誉的芒A胸ff消ym素et抢ri兵x承等公拿司使膀用该光技术毁合成捆探针虫外，狭其它特中小嘉型公贝司大炮多使届用合岂成点箱样法江。妹位后一塘方法茎在多芒聚物估的设皮计方侍面与茫前者舟相似艺，合喜成工脸作用庆传统奶的浸DN玉A叫或多搜肽固案相合插成仪薪以完念成，祥只是沙合成谈后用免特殊捉的自聋动化遮微量毒点样伙装置桌将其摩以比戴较高标的密呈度涂思布于迅硝酸久纤维惨膜、救尼龙沉膜或致玻片拔上。诉支持率物应每事先响进行君特定悔处理沙，例施如包庙被以乓带正波电荷偿的多冬聚赖筑酸或者氨基含硅烷酬。现甘在已剪有比绸较成卖型的扑点样残装置奏出售轿，如暴美国得B侍io证do队t鼻公司采的点汁膜产搭品以鸟及鞭Ca举rt挂es提ia娘n好Te剑ch朗no终lo诞gi丹es阵公戏司的素P阻ix稍Sy舱s屑NQ袭/P只A庙系列猫产品景。前弊者产扑生的茎点阵钞密度历可以办达到辱4道00揭/c初m2尸，傻后者捆则可难达到械2怕50厘0/限cm砖2阵。彩基因登芯片固的相跌关技讲术凡样品甘的准霜备及碧杂交晒检测剪霞目前扯，由恋于灵取敏度偶所限缓，多躲数方改法需专要在干标记膨和分飞析前服对样滔品进你行适标当程慎序的使扩增口，不葡过也淹有不愉少人吓试图讽绕过帽这一外问题帖，如概M测os辅ai在c抛Te惯ch惠no仔lo悔gi农es酱公爱司引蝇入的戏固相恢P中CR美方攀法，织引物键特异奇性强责，无斑交叉功污染莲并且称省去至了液逆相处归理的睬烦琐馋；壳Ly妻nx搁T仙he富ra丑pe送ut颠ic带s龟公司围引入挨的大坟规模薯并行飘固相倍克隆磁法免(M歌as女si叉ve支ly指p夸ar暴al侦le婚l悔so论li观d-尺ph枪as丽e治cl赖on莲in冠g)扣，剩可在飘一个突样品亡中同柱时对披数以虽万计肠的轨DN蛮A还片段锁进行码克隆格，且定无需讯单独歼处理失和分箩离每抹个克坏隆。涛葡醋显色卡和分夕析测凯定方板法主过要为加荧光致法，番其重员复性汽较好罢，不偿足的粥是灵灵敏度夸仍较弟低。茎目前恶正在天发展适的方傻法有熟质谱岛法、割化学铺发光付法、纲光导昼纤维闻法等材。以肺荧光舅法为匠例，颂当前终主要银的检峡测手负段是辣激光材共聚收焦显荐微扫柜描技报术，絮以便特于对柳高密廊度探涌针阵尺列每边个位宵点的存荧光聚强度获进行脉定量悉分析缓。因狭为探末针与奋样品掌完全犹正常桃配对狱时所茫产生其的荧阻光信瓦号强赏度是矿具有挥单个吴或两伟个错泄配碱战基探昨针的霸5著-3青5朱倍，流所以厕对荧最光信堡号强煤度精或确测面定是膏实现残检测逃特异痛性的倦基础冰[肥8]啊。酿但荧程光法声存在浑的问舞题是秤，只昏要标士记的摸样品裹结合垒到探显针阵征列上急后就赠会发杜出阳绢性信压号，旱这种痒结合郊是否军为正府常配章对，糟或正我常配榜对与居错配最兼而导有之彼，该喂方法胸本身棉并不澡能提草供足杆够的制信息拼进行享分辨胁。端爱对于甘以核麦酸杂并交为角原理牌的检粥测技体术，插荧光碌检测确法的窗主要坏过程愧为：银首先棵用荧施光素敢标记偷扩增洒（也矩可以煌有其彻它放撒大技顾术）槐过的巷靶序腔列或伪样品锄，然堂后与台芯片倍上的舞大量否探针积进行能杂交浇，将渡未杂蔽交的躬分子唐洗去想（如浇果用墓实时抖荧光贩检测苍可省瘦去此代步京[9晶]泼）这疗时，蓄用落碍射荧捷光显锯微镜笛或其必它荧馆光显临微装源置对皱片基育进行兼扫描示，采热集每扑点荧益光强盟度并榴对其除进行西分析稍比较肯。前琴已述撞及，善由于纵正常薪的妄Wa良ts玉on挎-C半ri绿ck掏配鬼对双附链要伸比具昼有错某配碱肥基的从双链绍分子鞭具有拿较高蚂的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基因扑，仅机掌握垂基因针序列删信息纠资料斤，要颤理解滚其基稠因功节能是疏远远吐不够稀的，乒因此娃，具估有监山测大泻量m新RN均A（睛信使坛RN暮A，喊可简其单理泽解为如基因睬表达输的中乡介物登）的愤实验颂工具罗很重多要。粘有关桨对芯枕片技句术检颂测基远因表蛙达及歌其敏联感性覆、特挖异性叹进行宇的研拴究实巡验表宣明芯臣片技辰术易挖于监参测非阿常大训量的像mR秤NA批s并展能敏红感地虚反映喘基因粥表达愧中的破微小煌变化欧。利嚼用基砍因芯垦片技举术人厌们已袍比较改成功饺地对无多种掠生物察包括航拟南龄芥、北酵母捏及人番的基梦因组能表达投情况佣进行姿了研族究，冬并且催用该准技术颈（共照15立7,织11遗2个绣探针肥分子铲）一办次性疤检测董了酵罗母几猾种不摘同株被间数菌千个腔基因屡表达螺谱的俭差异骗。糟2、鼻寻找啦新基蒙因。盘有关拆实验哄表明泽在缺全乏任挤何序您列信扔息的县条件至下，述基因羞芯片凳也可娇用于兽基因膊发现亲，如拒HM帜E基苏因和开黑色伯素瘤麻生长朋刺激指因子深就是予通过施基因旺芯片熔技术榜发现腹的。女3、滥DN蔬A测弓序。飞人类县基因顷组计战划衣的实娘施促萌进了门更高汗效率兴的、累能够兔自动助化操也作的翻测序揉方法栋的发劣展，沫芯片陶技术构中杂牲交测浪序技饺术及慕邻堆滔杂交添技术辣即是舌一种养新的渣高效浩快速撒测序鞠方法撑。如蚀使用螺美国御Af侄fy降me瘦tr术ix蜂公司市19佣98镜年生居产出匆的带睛有1可3.宗5万瑞个基院因探数针的于芯片膝就可蛋以使枝人类沉DN姥A解立码速舰度提兄高了未25怀倍。燕4、知核酸袖突变边的检赖测及强基因睬组多攀态性蝴的分振析。述有关柄实验怜结果缓已经纤表明胡DN谦A芯绑片技歼术配可快执速、徐准确纽地研浙究大劝量患爬者样渣品中萍特定牧基因贫所有俊可能泻的杂杯合变弯异。民对人产类基跟因组蜜单核线苷酸驳多态与性的餐鉴定庆、作远图和酒分型不，人列线粒杀体1激6.嗽6k骨b基芝因组科多态闸性的铺研究号等。说随着窃遗传户病与补癌症乔相关遣基因遵发现夺数量葡的增燥加，咬变异陡与多女态性江分析依必将苹越来接越重麻要。添基因箭芯片其技术停的研案究方计向及勤当前珠面临扬的困很难落劲尽管谦基因达芯片解技术雹已经稠取得唱了长爸足的梨发展酷，得的到世岸人的电瞩目广，但寄仍然垦存在拨着许勿多难贫以解勒决的切问题事，例喜如技怜术成筑本昂蓄贵、举复杂滨、检燃测灵却敏度王较低返、重耍复性果差、景分析宁泛围哀较狭浓窄等泥问题聚。这瓦些问莲题主透要表喉现在沙样品营的制欺备、险探针使合成踢与固店定、删分子禾的标得记、页数据穴的读蕉取与海分析艰等几这个方践面。可坝样品贪制备健上，讨当前棉多数世公司变在标风记和艳测定摩前都璃要对启样品坚进行讨一定顾程度镇的扩锻增以昌便提亩高检货测的涌灵敏岁度，膏但仍朱有不食少人施在尝秒试绕兆过该推问题胞，这果包括制M渡os挎ai舅c须Te哗ch舟no三lo忘gi损es优公遇司的绞固相终P岗CR止扩稳增体亩系以需及燥Ly浪nx农T党he狡ra闪pe微ut汁ic角s棚公司虎提出糊的大远量并呢行固炸相克矿隆方误法，卵两种比方法睛各有罩优缺暮点，么但目竖前尚器未取企得实别际应舒用。私式群探针尘的合由成与兔固定移比较俗复杂灭，特细别是洋对于柴制作典高密耽度的央探针厅阵列勾。使装用光覆导聚竖合技训术每孟步产遗率不跌高（逗9险5%桃）慕，难铜于保电证好渗的聚奇合效搂果。勺应运茄而生唤的其津它很境多方乖法，抖如压睛电打经压、哄微量务喷涂概等多至项技末术，异虽然退技术歌难度析较低胳方法垦也比猜较灵陵活，贱但存衔在的挺问题订是难茶以形积成高样密度辣的探诵针阵洪列，闹所以族只能届在较斯小规皱模上骡使用肥。最栋近我宣国学如者已辜成功撇地将帝分子盯印章旅技术与应用收于探皇针的料原位脏合成应而且淘取得狡了比终较满议意的医结果哗（个局人通猴讯）绸。独蓄目标宪分子劳的标郑记也招是一仓个重尿要的巧限速孩步骤狡，如乘何简桨化或纪绕过钉这一锤步现红在仍瞎然是宰个问肉题。屋己目标童分子昼与探爬针的饱杂交鹿会出驻现一暗些问申题：促首先伪，由貌于杂瓦交位毁于固升相表辨面，灯所以杰有一压定程赔度的逼空间世阻碍勒作用书，有虑必要政设法舅减小锤这种斯不利俱因素旬的影讨响。化S诚ou绍th镰er男n珠曾通店过向葡探针夕中引废入间眠隔分京子而冶使杂宣交效伤率提奉高于旨了不15西0竖倍。介其次隙，探糊针分荐子的艇G景C缩含量确、长饺度以挑及浓角度等描都会解对杂挣交产览生一寻定的妇影响扰，因口此需规要分短别进冲行分浙析和谋研究疮。志信号席的获蹈取与罩分析嚷上，芝当前术多数失方法纪使用恼荧光距法进己行检荡测和违分析侦，重胃复性裤较好啄，但欲灵敏恳仍然饮不高裕。正齿在发嘴展的射方法壤有多萍种，似如质皆谱法暗、化闲学发蠢光法板等。丘基因却芯片身上成费千上晴万的缩寡核鞠苷酸奉探针栏由于渗序列象本身弱有一仆定程访度的籍重叠丽因而方产生蒸了大狠量的扮丰余仓信息岂。这某一方滥面可恒以为陪样品嫩的检奴测提念供大说量的震验证坐机会径，但认同时料，要形对如造此大剃量的睁信息抛进行凳解读偶，目降前仍宋是一吼个艰狠巨的诊技术漫问题链。格我国霞基因芦芯片孝的研崇究现书状获目前需，我客国尚国未有甲较成鞠型的喘基因拆芯片撤问世佣，但便据悉姻已有搭几家旨单位发组织关人力暖物力菠从事病该技禁术的稼研制斤工作纷，并猜且取播得了塞一些阅可喜祥的进乏展。用这是伐一件馅好事滑，标工志着圣我国渔相关膏学科门与技俘术正诊在走颗向成心熟。伪基因拦芯片培技术恼是一蹦个巨恭大的栽产业逼方向治，我潜们国石家的筑生命医科学梯、计袜算机趴科学秆乃至晋精密忘机械船科学爬的工辽作者索们应闭该也令可以隐在该寄领域堆内占燕有一沙席之宾地。崇但是通我们防应该粘充分篮地认纪识到抹，这贱不是僚一件兔轻易限的事弄，不淡能够摔蜂拥膜而至绪，不雷能“姓有条慎件没层有条华件都亿要上虑”，秃去从塞事低忌水平腹重复塘性的虹研究食工作墨，最批终造俱成大移量人瞧力物清力的籍浪费泰。而令应该径是有谅组织淋、有宏计划拖地集衰中具已有一愈定研布究实槽力的医单位但和个竞人进关行攻群关，的这也戚许更衫适合阳于我妙国国可情。溪基因盖芯片拢在临智床疾雨病诊雕断的更应用基因芯片（Genechip）又称DNA芯片（DNACHIP）、DNA阵列（DNAarrays）、寡核苷酸微芯片（oligonucleotidemicro-chip），是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。90年代初，由美国Affymetrix公司的Fodor博士提出并开始基因芯片技术的研究，至今，基因芯片技术在医学各个领域中的应用均已取得巨大突破。1998年底，美国科学促进会将基因芯片列为1998年度自然科学领域十大进展之一。1

基在芯片制备技术

基因芯片的实质是高度集成的寡核苷酸阵列，制造基因芯片首先要解决的技术是如何在芯片片基上定位合成高密度的核酸探针。目前，基因芯片的制备技术主要有以下几种：

1.1

原位合成

是指直接在芯片上用四种核苷酸合成所需探针的基因芯片制备技术，主要包括：

原位光刻成

是由美国Affymetrix公司发展的结合了半导体工业的光刻技术和DNA合成技术制造高密度核酸阵列的基因芯片制备技术。它利用光保护基团修饰芯片片基表面碱基单体的活性羟基，通过设计特定的光刻掩膜和不断地更换曝光区域，直接在片基上合成所需高密度寡核苷酸阵列，探针数目在合成循环中呈指数增长，例如一个完整的十核苷酸序列通过32个合成步骤，8个小时即可成65536（216）条探针。1.1.2

原位喷印合成

芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉；采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂。1.1.3

分子印章多次压印合成

根据所需微阵列，设计有凹凸的微印章，然后根据预先设计在制备的各级印章上涂上对应的单核苷酸；按照设计的顺序将不同的微印章逐个依次压印在同一基片上，得到256×256阵列的高密度基因芯片。其主要优势有：采用了平面微细加工技术，可实现大批量生产；通过提高集成度，降低单个芯片的成本；可组装大量的（104-106种）生物分子探针，获取信息量大，效率高，特别适合于基因信息的采集；结合微机械技术（MEMS），可把生物样品的预处理、基因物质的提取、扩增，以及杂交后的信息检测相集成，制备成缩微芯片。1.2

合成点样

是指将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片片基上。合成点样技术在基因芯片尚处于实验研究阶段时是唯一的芯片制造手段，曾一度被原位合成技术的光芒所掩盖。随着原位合成技术缺点的暴露和自动化技术的进步，合成点样技术又重现生机。目前，除Affymetrix等研究和生产基因芯片的少数大人司使用原位合成外，其他中小型公司和实验室研究中仍然普遍采用合成点样法。1.2.1

微型机械点样法

该技术是由Shalon和Brown于1995年发展起来的一类芯片制备技术，而后由美国Synteni公司发展出商品仪器。该方法通过毛细作用使用点样针将生化物质转移到固体基底表面（点样针与基底表面接触），每一轮结束后，清洗点样针进行下一轮操作，而且机器人控制系统可使其实现自动化生产。1.2.2

化学喷射法

此方法先进之处在于采用了坟电和其也推动方式从微型喷嘴向固体表面转移生化成分（cDNA、DNA、抗体、小分子等）。该技术由IncytePharmaceuticals和Protogene公司等发展。该方法通过应用与压电接口相连的微型喷嘴将生化物质喷向基底，通过电流控制使样品体积得到精确控制。

1980年Bains等将预先合成的短DNA片段固定在固相支持物上进行的杂交测序基因芯片的最原始模型，所以合成点样是基在芯片制作的最原始的方法。由Affymetrix公司发展起来的光导ODTA合成照相平板印刷术将基因芯片引入了工业化生产的阶段。将样品处理、芯片杂交和信号检测集于一体的“缩微实验室”逐渐成为基在芯片发展的新趋势，此方面主要有以下技术较为成功：电子芯片、三维芯片、流过式芯片、石英谐振芯片。2

基因芯片在临床疾病诊断中的应用2.1

核酸序列分析

核酸序列分析是基因芯片发展和应用的基础。基因芯片技术可在一次反应中对一个样品进行大量杂交反应，并可对这些杂交信号进行平行分析，因而被广泛应用于DNA序列分析，特别是杂交测序（sequencingbyhybridization,SBH）和邻堆杂交技术（contiguousstackinghybridization，CSH）。2.1.1

杂交测序技术

采用SBH技术，用含65536个8聚寡核苷酸的微阵列，可测定200bp长DNA序列，采用67108864个13聚寡核苷酸探针的微阵列，可对数千个碱基长的DNA测序。Chen等用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列，准确率达99%。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异，结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之间，提示了二者在进化上的高度相似性。2.1.2

邻堆杂交技术

SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵的复杂性，降低了杂交准确性。CSH技术弥补了SBH技术存在的弊端，CSH技术的应用增加了微阵列中寡核苷酸的有效长度，加强了序列准确性，可进行校长的DNA测序。2.1.3

毛细管电泳芯片测序技术

Mathies等成功地应用通过光刻加工出的毛细管电泳测定芯片在10min内完成了含433碱基对的DNA序列测定。美国的CuraGen公司和普林斯顿大学也正在从事这类芯片的研究开发工作。2.2

基因表达分析

随着人类基因组计划的顺利进行，基因组研究的重心转到了功能基因组学，基因表达芯片为此提供了最好的技术平台，用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地成千上万个基因的表达情况。对大多数基因而言，mRNA表达水平与其蛋白质的表达水平相对应，基因芯片技术可直接测到mRNAr的种类及丰度，可快速地以1：300000水平出现的mRNA。表达谱基因芯片研究基因表达与传统的NorthernBlot相比有许多优点：系统微型化，样品需量极小；同时研究上万个基因的表达，研究效率明显提高；能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的作用关系；检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表达情况；节约费用和时间。2.3

寻找新基因

定量检测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗等方面是很有价值的。基因芯片技术在发现新基因及分析各个基因在不同时空表达方面是一项十分有用的技术，它具有样品用量极少，自动化程度高等优点，便于大量筛选新基因。目前，大量人类ESTs给cDNA微阵列提供了丰富的资源，数据库中400000个ESTs代表了所有人类基因，成千上万的ESTs微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工具。这将大大地加速人类基因组的功能分析。2.4

突变体和多态性检测

检测基因突变对于阐明肿瘤与遗传病的分子机制、疾病的早期诊断具有重要意义。以往研究突变和多态性时多采用PCR-SSCP、手工或自动测序、异源双链分析、蛋白截短检测等方法，所有这些都需经过电泳环节，不能满足大规模、低消耗和自动化的要求。应用基因芯片方法检测时可克服上述不足，且与DNA聚合酶或连接酶结合检测时可获得更高的分辨率。Hacia等用含96000个寡核苷酸探针的基因芯片来检测遗传性乳腺癌基因儿卵巢癌基因BRCA1第11外显子3.45kb长度内的所有可能的发合性突变，包括碱基替换及小的插入、缺失乖，并借此确定发病风险，检测准确率高达99%。基因芯片也可用于肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤的研究中，为肿瘤基因组解析计划（CGAP）的完成提供重要的技术支持。Lipshutz等证明基因芯片可用来筛选HIV病毒的蛋白酶基因和反转录酶基因的突变。这些突变能引起对抗生素，如AZT等的抗性。Affymetrix公司已制造出商用HIV芯片，包括1040个蛋白酶和反转录酶基因，用来研究病毒抗性发展过程中的碱基突变。Chee等制造了含有135000个25-mer探针的基因芯片来探测16.6kb的人线粒体基因组，共分析了10个样本，检出505个多态。每个样本可在12min内阅读完毕，正确率达99%。在多态性分析方面，基因芯片技术用于基因组研究可创造第三代遗传图，即将遗传病表型与DNA上特定的基因序列联系起来，以单核苷酸多态性（SingleNucleotideePolymorphisms,SNPs）为标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异，若能将所有SNPs全部信息装入生物芯片则可检测到与之相关的基因间差异。

2.5

后基因组研究

基因组测序完成后，未知基因的功能研究是一个十分诱人的后基因组研究课题。斯坦福大学的Davis研究小组的研究提示DNA芯片技术将来可能应用于人类基因组测序完成后阐明开放读码框架ORF生物学功能的研究，可能会对深刻认识生命现象及药物设计带来重大影响。Davis研究小组利用DNA芯片技术对酵母缺失突变株进行定量分析以确定酵母全序列测定完成后新发现的ORF的生物学功能。他们应用基因打靶技术产生多个ORF缺失的酵母突变株，并在缺失ORF旁引入20个核苷酸的标志序列作为缺失ORF的身份标志，谓之“分子条形码”（molecularbarcodes）,分子条形码可与基因芯片上的探针进行杂交以便于筛选。这样ORF的功能测试可通过一次杂交及用同一生长选择条件完成，大大提高了效率和准确性。2.6

疾病的诊断

从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。例如,Affymetrix公司和Oncormed公司合作研制的可监测50%以上肿瘤患者p53基因突变的p53基因芯片将在癌症早期诊断中发挥作用。基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比，它可以在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测，勿需机体处于免疫应答反应期，能及早诊断，待测样品用量小；能特异性检测病原微生物的亚型及变异；可帮助医生及患者从“系统、血管、组织和细胞层次（第二阶段医学）”转变到“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次（第三阶段医学）”上了解疾病的发生、发展过程。这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量发展过程。这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病诊断信息，有助于医生在短沓间内找到正确的治疗措施。橡2.会6.起1

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芯片实验中核酸的抽提没有特殊之处，参照常规的分子生物学实验手册就可以。但对于RNA样本，由于RNA的稳定性很差，在活体内的半衰期也很短，因此取材一定要新鲜，取材后迅速保存在液氮中，在整个处理过程中要非常小心，以免降解，影响实验成功率或结果的可靠性。2．核酸标记方式

分子生物学常用的标记方法有同位素标记和非同位素标记方法，常用的同位素有33P、32P、125I及3H等化学发光标记和荧光标记，非同位素标记方法又分为化学发光法和荧光法。常用的化学发光物质有碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，它们能催化相应的底物产生有颜色的沉淀物；生物素和地高辛是最常用的非同位素标记物。很多荧光染料、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶可直接同抗地高辛抗体及亲和素偶联。而目前常用的荧光染料种类有德克萨斯红(Texasred)、荧光系、罗丹明、Cy3、Cy5等。生物芯片中的标记方法普遍采用荧光方法，很少采用化学发光法和同位素标记方法。核酸样本通常采用酶反应法进行标记，蛋白质样本采用化学方法或抗体—抗原间接标记的方式。核酸中常用的酶反应方法有：反转录法、随机引物法、切口平移(nicktranslation)、PCR、体外转录等。在酶反应过程中掺人带荧光的dNTP，从而标记新合成的核酸分子。如果酶反应中需要引物，如PCR、随机引物法和反转录法，也可以将荧光基团通过化学反应加到引物的末端。3．样品标记方法

样本标记方法很多，这里仅举几种常用的方法。

(1)RNA标记方法：对于表达谱基因芯片和RNA不同剪切体的研究，是针对RNA样本进行标记。最常见的标记方式是用Cy3或Cy5荧光，通过反转录标记法，选择不同激发波长的荧光标记不同的样本。如Cy3或Cy5标记的dNTP，通过酶反应掺人到待测样品中，便可以在一张片子上同时检测两份标本的信息，做到平行性比较，数据更可靠。另外，由于反转录法所需RNA样本量大，一般需要20fig的总RNA。对于微量的组织样本很难制备足够的RNA，这时可以采用RNA线性扩增方法，最普遍采用的RNA扩增方法是RNA体外线性扩增方法。

(2)DNA样本的标记方法：当对样本进行CGH分析、SNP、分子分型或甲基化研究时，主要选用DNA作为样本。对于CGH，可以进行全基因组标记，通常采用随机引物标记方法。这种方法需要的DNA量大，一般在2pg以上的基因组DNA。虽然有人发明了全基因组DNA的线性扩增技术以减少对样本量的需求，但效果上都不很理想，很难真正做到全基因组及完全的线性扩增。对于SNP研究，可以采用类似CGH的标记方式进行全基因组标记。由于SNP检测的是DNA的“质”，而不像表达谱或CGH质检测核酸的“量”，因此不必要考虑标记时DNA的线性关系，可以采用其他的全基因组的扩增方法。但由于杂交条件的限制，一般难以做到真正意义上的高通量。因此，一般只是选择少数目的基因的少数SNP位点进行研究，可以采用多重PCR标记方法标记目的片段代替全基因组标记。甲基化研究有两种方案，一种采用SNP的检测原理，另一种类似CGH的方法。Affymetrix基因芯片前景Affymetrix基因芯片技术是用于基因组学和转录组学研究的整合平台，该技术平台既可以分析基因组DNA，也可以分析RNA，在DNA水平上既可以做SNP分析，也可以做DNA再测序。Affymetrix基因芯片技术是基因芯片领域的国际行业标准,已经为国际生命科学和医学、植物及微生物等基础研究领域广泛认可,利用Affymetrix基因芯片技术作为主要研究手段之一在国际科学杂志发表的论文达7336篇(今年1-9月已经有2103篇),仅在Nature,Science,新英格兰医学杂志和Cell影响因子非常高的杂志发表的论文就数百篇.Affymetrix基因芯片技术也正在走向实际应用.2004年,Affymetrix的仪器和芯片制造设备通过ISO认证,其GeneChip(R)System3000Dx(GCS3000Dx)通过美国FDA和欧盟CE认证,成为第一个可以分析体外诊断芯片的基因芯片系统,成为核酸诊断(基因型分析和基因表达分析)的标准平台.Affymetrix基因芯片系统截止06年03月底在全世界的装机量超过1420套(其中超过80套GCS3000Dx售给Affymetrix的诊断开发合作伙伴及检验科),在整个基因芯片领域是首屈一指和独占鳌头的.国际上著名的大学,研究机构和跨国制药公司几乎全部具有Affymetrix基因芯片技术平台.就在发明基因芯片点样技术的斯坦福大学就有10套系统。目前可以提供生命科学研究和医学研究的模式生物的全基因组表达谱芯片,包括牛、线虫、狗、鸡、果蝇、大肠杆菌、人、小鼠、绿脓杆菌、按蚊/疟原虫、猪、恒河猴、大鼠、金黄色葡萄球菌、爪蟾、酵母和斑马鱼等。其中鸡表达谱芯片不仅可以检测鸡的mRNA表达,同时可以检测禽类17种病毒的684个基因的表达。而恒河猴表达谱芯片可以检测恒河猴和灵长类病毒的基因表达。利用表达谱芯片，通过对已经鉴定的基因及其剪接体表达水平的检测，已经发表了诸多论文,并且还有用表达普芯片找到疾病易感基因的报道(Science.308(5720):385-9,2005Apr15.Epub2005Mar10)。该论文利用100KSNP芯片技术扫描96个病人和50个正常人，直接找到了黄斑变性的易感基因为CFH。而03-04年有5篇国际论文在寻找该疾病的易感基因，由于这5篇论文都用STR技术，因此没有找到易感基因，只证明1号染色体的某个区域与该疾病有关。SNP芯片找到的黄斑变性易感基因CFH就在该染色体区域内！顶级医学杂志"新英格兰医学杂志"今年六月这期又发表了利用AFFYMETRIX表达谱技术的两篇论文:利用基因表达谱芯片技术改进了伯杰氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)诊断的精确度!!!被病理专家分类为Burkitt'slymphoma的病人的基因表达特点完全可以把Burkitt'slymphoma及弥散性大B细胞淋巴瘤(diffuselarge-B-celllymphoma)区分开!两个研究分别做了220和303例病人的基因表达Affymetrix基因芯片技术被广泛应用于人类和动物生命科学的基础研究中,如鉴定发育、生长、分裂、分化、细胞凋亡、信号转导等重要生命过程的相关基因,鉴定疾病相关基因,如大量的研究在利用基因芯片技术鉴定癌症发生发展和转移的基因,对癌症进行分子分类/分期，寻找癌症分子机制的关键分子,为癌症诊断筛选重要标志分子,为癌症治疗筛选重要的靶分子,预后分析等.Affymetrix的SNP芯片可以用于在全基因组水平上寻找人类疾病或其他性状的相关基因,即用于医学遗传学的连锁分析(linkage,10/50K)和关联分析(association,100/250/500K/1000K).由于SNP是比STR密度很高的分子标记,因此与STR技术做连锁分析(linkage)来寻找疾病/性状相关基因相比较,100/250/500K/1000KSNP芯片技术做关联分析(association)可以精确地将特定基因与疾病/性状直接关联起来,而STR全基因组扫描连锁分析只能先找到与疾病/性状相关的染色体区域(长达5-10Mbp或更长、含数十到数百个基因),进一步还得利用该区域更密的分子标记(如加密STR或SNPs)分析技术来找到疾病/性状的基因.SNP芯片推出四年来,已经发表了很多研究文献(,这些文献涉及疾病/性状相关基因寻找(即linkageanalysis和GENOMEWIDEASSOCIATION),群体遗传学(populationgenetics),染色体拷贝数变化分析(chromosomalcopynumberchangesduringcancerprogression,即染色体缺失,扩增和LOH).目前,在全球范围内已经有数百个大学,研究机构和制药公司在利用SNP芯片技术进行相关研究.Affymetrix可以提供3种规格人的SNP芯片,分别是:10K,50/100K和250/500K/1000K,一次性分析人的1万个、10万个、50万、100万个SNP位点，并告知的是该位点的序列信息。短短的两三年时间里仅疾病易感基因定位的报道就有几十篇，还有许多其它研究的报道SuperArray基因芯片实验操作步骤SuperArray基因芯片实验操作步骤:RNA抽提RNA质量检测探针合成芯片杂交化学发光检测图象采集和数据分析RNA抽提TRIZOL试剂(Invitrogenlifetechnologies)氯仿异丙醇75%乙醇(以DEPC处理的水配制)无RNA酶的水无RNA酶的糖原(Invitrogenlifetechnologies)1.匀浆a.组织匀浆每50-100mg组织样品,加入1ml的TRIZOL试剂,用电动匀浆器进行匀浆.所加样品体积不能超过匀浆此样品所使用的TRIZOL试剂体积的10%.b.单层贴壁细胞匀浆直接在3.5cm直径的培养盘中加入1mlTRIZOL试剂裂解细胞,裂解时用枪吸打几次.加入TRIZOL试剂的量取决于培养盘的面积(每10cm2加1ml)而不是培养细胞的数量.c.悬浮细胞的匀浆离心沉淀细胞.加入TRIZOL试剂反复吹打使细胞裂解.每5-10×106的动物植物或酵母细胞或者每1×107的细菌使用1mlTRIZOL试剂,避免在加入TRIZOL试剂进行裂解前清洗细胞,因为清洗会很可能导致mRNA的降解.对于某些酵母和细菌的细胞,需要使用匀浆器来破碎细胞.2.两相分离匀浆后样品于15到30°C孵育5分钟,以便核酸蛋白复合体完全解离.每1ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖.手动剧烈振荡管体15秒后,15到30°C孵育2到3分钟.4°C下12,000×g离心15分钟.离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层核上层的无色的水相.RNA全部被分配于水相中.水相的体积大约使匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%.3.RNA沉淀将水相转移到新离心管中.水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA,加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1mlTRIZOL试剂的此时加0.5ml的异丙醇.混匀后15到30°C孵育10分钟后,于4°C12,000×g离心10分钟.此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块.4.RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75%乙醇,清洗RNA沉淀.振荡后,4°C7,500×g离心5分钟.5.重新溶解RNA沉淀去除乙醇溶液,空气中干燥RNA沉淀5-10分钟,切勿真空离心干燥.注意RNA沉淀不要完全干燥,否则将大大降低RNA的可溶性.部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6.溶解RNA时,先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次,然后55到60°C孵育10分钟.获得的RNA溶液保存于-70°C.小量RNA的抽提:从少量的组织(1到10mg)或者细胞(102到104)样品中抽提RNA:加入800l的TRIZOL试剂至样品中,样品裂解后,按步骤2加氯仿进行两相分离.在加异丙醇沉淀RNA前,加5-10ug的无RNA酶的糖原作为水相载体.为降低溶液粘度,在加氯仿前先将样品两次过26号针头以剪切基因组DNA.两相分离后糖原留在水相中并和RNA共沉淀.只要糖原浓度不高于4mg/ml,不会影响cDNA的合成,同样也不会对PCR过程产生影响.RNA质量检测TE:10mMTris-HClpH8,1mMEDTA0.4MMOPS,pH7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA甲醛甲醛上样染液(ambion,)溴化乙锭(EthidiumBromide,EB)琼脂糖1.紫外吸收测定法取少量液体用TE稀释(一般1:100稀释)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,可以测定RNA溶液浓度和纯度.用来稀释的TE不需要经过无RNA酶处理,因为RNA的微量降解不会明显影响分光光度计的读值.测量前需先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零.a.浓度测定A260下读值为1表示40gRNA/ml.样品RNA浓度(g/ml)计算公式为:A260X稀释倍数X40g/ml.具体计算如下:RNA溶于40lDEPC水中,取5ul,1:100稀释至495l的TE中,测得A260=0.21RNA浓度=0.21X100X40g/ml=840g/mlor0.84g/l取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35l,剩余RNA总量为:35lX0.84g/l=29.4gb.纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法,比值范围1.8到2.1.即使比值超出这个范围,RNA样品也一样可以用于一些普通实验中如Northern杂交,RT-PCR和RNA酶保护实验.样品OD260OD280OD260/OD280RNA浓度(ug/ul)A1.0760.5421.998.61B1.0500.5831.808.402.变性琼脂糖凝胶电泳a.制胶1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60°C,10ml的10XMOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M).10XMOPS电泳缓冲液:浓度成分0.4MMOPS,pH7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25l溶液.胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1XMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米.b.准备RNA样品取3gRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10g/ml.加热至70°C孵育15分钟使样品变性.c.电泳上样于胶孔中,5–6V/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm.d.紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍.还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成.在18S和28S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成.RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带.RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散.探针合成方法一:用于化学发光检测的RT标记法无RNA酶的H2O10×RT缓冲液(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-04)RNA酶抑制剂,RNaseInhibitor(Promega,CatNo.N2511)MMLV逆转录酶,MMLVReverseTranscriptase(PromegaCat.No.M1701)缓冲液A(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-04)生物素标记dUTP,Biotin-16-dUTP(RocheCat.No.1-093-070)DTTdNTP混合液(dATP,dCTP,dGTP和0.5mMdTTP各5mM)a.配制缓冲液BN取50μL的10XRT缓冲液,1μL的1MDTT和50μL的dNTP混合液,混匀,保存于–20°C.b.配制退火混合液:每个总RNA样品如下配制于一个灭菌PCR管中:总RNA5.0μg缓冲液A3μl无RNA酶的H2O加至总体积为10μl上述溶液用枪轻轻吸打混合均匀,离心至管低.混合液放于70°C水浴锅中孵育3分钟,立刻放在42°C水浴中孵育2分钟.c.配制RT混合液:当退火混合液70°C孵育时即可配制RT混合液.RT混合液1张芯片2张芯片4张芯片缓冲液BN4μl8μl16μlBiotin-16-dUTP2μl4μl8μl无RNA酶的H2O2μl4μl8μlRNaseInhibitor1μl2μl4μlMMLVReverseTranscriptase1μl2μl4μl总体积10μl20μl40μlRT混合液42°C孵育1分钟,然后进行下一步骤.d.RT反应:每张芯片探针制备:加10μl预热的RT混合液到10μl退火混合液中,用枪轻轻吸打混匀,继续在42°C孵育90分钟.e.探针变性:反应得到的cDNA探针于94°C加热5分钟,然后迅速放入冰中.此cDNA探针即可用于杂交.方法二:用于化学发检测的AMPOLABELING-LPR标记法RT引物(P)(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-03)无RNA酶的H2O(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-03)10×RT缓冲液(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-04)缓冲液AF(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-03)LPR缓冲液(L)(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-03)DNA聚合酶(LE)(SuperA