微生物诊断技术

微生物诊断技术第一页，共八十六页，编辑于2023年，星期三学习内容免疫学技术分子生物学技术细菌检验的自动化第二页，共八十六页，编辑于2023年，星期三参考书Microbiology

NinaHorne,SamuelSubityTextbookofmedicalmicrobiologyandparasitology

KennethJ.Ryan

科学出版社临床微生物学与微生物检验

张卓然主编人民卫生出版社第三页，共八十六页，编辑于2023年，星期三细菌感染的实验诊断感染性疾病的实验诊断涉及微生物学、免疫学、生化、临床抗生素学、医院感染学、流行病学。临床细菌实验室主要工作—从临床标本中分离出病原菌，并进行准确鉴定，同时指导临床合理用药。第四页，共八十六页，编辑于2023年，星期三细菌感染的实验诊断临床诊断目的：1）以疾病的病原学诊断为目的，一般鉴定细菌种类，必要时进一步鉴定。2）为提供治疗方案为目的，进行临床标本的直接药物敏感试验，还可根据病原菌的种类直接提供抗生素的范围和种类。3）以流行病学研究为目的，对病原菌做进一步鉴定，往往鉴定到型。4）了解细菌与感染的关系，感染的类型以及细菌的种类并非具有专一性。第五页，共八十六页，编辑于2023年，星期三第一部分免疫学技术免疫学鉴定和免疫学诊断免疫学鉴定-用已知的抗体检测标本中或分离培养物中的未知病原生物，确定生物的种或型。免疫学诊断-用已知的病原生物或其特异抗原检测患者血清中相应的特异抗体及效价的变化。第六页，共八十六页，编辑于2023年，星期三一、凝集反应1玻片凝集反应，用已知抗体的诊断血清，在玻片上直接与细菌培养物或细菌悬液混合，若有与抗体相应的细菌，出现肉眼看见的凝集块或颗粒。2反向间接凝集试验，将已知的细菌抗体直接吸附或通过化学偶联方法结合于RBC表明，制成抗体致敏细胞，再与被检物混合。第七页，共八十六页，编辑于2023年，星期三一、凝集反应3乳胶凝集试验，将已知的抗体吸附在聚苯乙烯颗粒上，可与相应抗原产生肉眼可见的乳胶凝集现象，借以坚定细菌。4协调凝集试验，金黄色葡萄球菌细胞壁中的A蛋白（SPA）能够与人或哺乳动物的IgG-Fc段结合，使Fc暴露于葡萄球菌的表面，保留其抗体活性和特异性。当金黄色葡萄球菌与已知的IgG抗体连接时，成为致敏的颗粒载体，与相应抗原或细菌接触时，则出现肉眼可见的凝聚现象，借以证明相应的细菌或抗原的存在。第八页，共八十六页，编辑于2023年，星期三二、免疫荧光技术1直接法，将已知抗体用化学方法结合荧光素制成荧光抗体，以此来浸染固定在玻片上的未知细菌。2.间接法，将已知抗体与待检细菌标本充分反应后加入荧光素标记的抗IgG抗体，形成抗原-抗体复合物，可与随后加入的荧光标记IgG抗体进一步结合而固定于玻片上，在荧光显微镜下可见荧光出现。第九页，共八十六页，编辑于2023年，星期三二、免疫荧光技术3免疫荧光菌球法，荧光抗体直接染色与增菌培养相结合的方法，培养基中加入一定量的荧光抗体，然后接种标本，若有相应的病原菌，抗体与之结合而凝聚，聚会后得到的细菌继续增殖而聚合成团，在荧光显微镜下称绒球团样荧光。第十页，共八十六页，编辑于2023年，星期三Enzyme-LinkedImmunosorbentAssayIndirectELISAUsetotestAb第十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期三

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssaySandwichELISA

UsetotestAg

DirectELISA第十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期三1.Enzymology:Modifyingenzymes(1)• DNApolymerases(synthesizeDNA)• DNAligases(joinDNAstrandsbyformingaphosphodiesterbond)• Kinases(phosphorylationof5´-terminusofDNAmolecule)第二部分分子生物学技术第十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期三Enzymology:RestrictionendonucleasesBamH1

GGATCCCCTAGGHaeIIIGGCCCCGGCohesiveEnds(5´Overhang)CohesiveEnds(3´Overhang)KpnIGGTACCCCATGGBluntEnds(NoOverhang)第十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期三Enzymology:Restrictionendonucleases

GATCCTAGDpnI(Requiresmethylation)Methylation-sensitiveEnzymesGGCCCCGGHaeIII(Inhibitedbymethylation)CCCGGGGGGCCCXmaI(59Overhang)CCCGGGGGGCCCSmaI(BluntEnds)IsoschizomersEnzymesGeneratingCompatibleCohesiveEndsGGATCCCCTAGGBamHI(59Overhang)AGATCTTCTAGABglII(59Overhang)CTCGTGGAGCAGBssSI(59Overhang)NNCAGTGNNNNGTCACNNTspRI(39Overhang)EnzymesRecognizingNon-palindromicSequences第十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期三1.PCRAmplificationPolymeraseChainReactionThepolymerasechainreaction(PCR)isatechniquefortheinvitroamplificationofspecificDNAsequencesbyprimerextensionofcomplementarystrandsofDNA第十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期三PCRAmplification:AmplificationApproachestoamplificationWantedawaytogeneratelargeamountsofDNAfromasinglecopyInitiallyusedthe“3graduatestudent”methodDenaturingAnnealingExtending第十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期三PCRAmplification:AnoverviewMechanismofPCRTargetSequencePCRCyclingTaqPolymerasePCRCyclingTaqPolymerasePCRproducts第十八页，共八十六页，编辑于2023年，星期三PCRAmplification:AnoverviewPCRcyclingAdditionalCyclesofAmplificationPrimer1Primer2Cycle1Cycle2Cycle3第十九页，共八十六页，编辑于2023年，星期三PCRAmplification:PCRreaction(2)PCRcomponents• DNApolymerase(Taq)• dNTPs• Reactionbuffer• Primers(15–25bp)• TargetDNA(ssDNA)PCRThermocycler第二十页，共八十六页，编辑于2023年，星期三PCRAmplification:PCRreactionPCRcyclingssDNAannealingdsDNAdenaturationPrimerhybridizationPolymerase/DNAsynthesisextension1PCRCycle(15–30seceach)94°C50–60°C72°C第二十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期三PCRAmplification:PCRreactionStandardPCRreaction25–100ngDNAtemplate50mMKCl10mMTrisHCl(pH8.4)1.5mMMgCl2gelatin0.25mMeachprimer200mMeachdNTP2.5UTaqpolymerase第二十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期三3.PCRAmplificationDiagnosticPCRamplificationfrompatientsamplesNegativePositiveSpecimen1Specimen1Specimen2Specimen2DNAMarkerBlankNegativePositiveSpecimen2Specimen1EBV-Actin第二十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期三HybridizationMethods:ConceptHybridizationistheprocesswhereapieceofnucleicacidisincubatedwithitscomplementarystrand,eitherinsolutionorwithonestrandonasolidsupport,andthetwostrandsbindtogetherbyhydrogenbonding第二十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期三HybridizationMethods:Concept• HybridizationcanbebetweenDNAandDNA,DNAandRNA,RNAandRNA,oreithernucleicacidandsyntheticoligonucleotids• Southernblot:theprocedurefortransferringdenaturedDNAfromanagarosegeltoanitrocellulosefilterwhereitcanbehybridizedwithacomplementarynucleicacid第二十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期三HybridizationMethods:SouthernblotSouthernBlotAnalysis第二十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期三HybridizationMethods:SouthernblotSouthernBlotAnalysis• Vacuumorcapillaryaction:–DNAisdenaturedinsitu(inthegel)–DNAfragmentstransferredfromgeltosolidsupport• Largefragmentstransferslowerthansmallfragments• Geltreatment:–Depurinatewithweakacid(reducesfragmentsizeandincreasestransferefficiency–Denaturewithstrongbase,NaOH(hydrolyzesphosphodiesterbackboneatdepurinatedsites)第二十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期三HybridizationMethods:SouthernblotSouthernblotanalysisofgenomicDNA23.19.46.6第二十八页，共八十六页，编辑于2023年，星期三第三部分细菌检验的自动化第二十九页，共八十六页，编辑于2023年，星期三第三十页，共八十六页，编辑于2023年，星期三第三十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期三一、微生物鉴定系统发展概况60年代细菌鉴定方法（手工配制的试剂培养坚定细菌生化反应）。70年代根据细菌生物学性状和代谢产物的差异，发展了微量快速和生化反应系统，具有简易化、微量化、系统化、商品化和标准化等优点，并实现了从生化模式到数字模式的转化。形成自动化微生物分析系统。第三十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期三第三十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期三第三十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期三细菌鉴定自动化组别试验项目代码结果结果代码总值1葡萄糖酸盐笨丙氨酸硫化氢124+--10012枸橼酸盐甲基红靛基质124++-1203数字编码鉴定法第三十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期三第三十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期三二、微生物数码分类鉴定系统

采用标准化、商品化和配套的生化反应试剂条（板），可将细菌鉴定到属、群、种和亚种或生物型，并可对不同来源的临床标本进行针对性的鉴定。优点：简易化、微量化、系统化、商品化、标准化。第三十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（一）工作原理1．数据库，由许多细菌条目组成。每个条目代表一个细菌种或一个细菌生物型。

2．编码，将细菌生化反应模式转换成数学模式，可把生化反应结果快速转录成数字（编码），经查阅编码检索本或电脑分析系统又可将数字转化成相应的细菌名称第三十八页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（一）工作原理3．查码在编码检索本内寻找数码信息：如菌名，鉴定结果的评价，生化结果，阳性百分率，必须增加的补充试验项目，指出注意要点等。第三十九页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（一）工作原理4．解释如果排序第一的细菌％id≥80.0，则可按值的大小对可信度作出评价，如果第1条目的细菌％id＜80.0，就将前3个条目加在一起；若还不足80.0，则此结果是不可接受的，既不属于同一细菌种，又不属于同一细菌属。第四十页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（二）数码分类鉴定系统组成和操作

1．数码分类鉴定系统由试剂条、添加试剂及检索工具配套形成的鉴定体系。（1）试剂条：常用的生化反应有①发酵试验；②同化试验；③同化或发酵抑制试验；④酶试验；⑤其他传统的生化反。第四十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（二）数码分类鉴定系统组成和操作（2）添加试剂：有些试验经孵育后需添加试剂才能呈现颜色变化。添加的试剂有配套试剂盒或单种试剂。（3）检索工具：检索工具包括鉴定表、编码本和电脑软件，可供人工查阅鉴定结果或由电脑自动处理并报告。每盒试剂条中均附有操作说明书，包括鉴定百分率表。

第四十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（二）数码分类鉴定系统组成和操作2．操作要点（1）准备1）标本经分离培养得到纯菌落。2）借助涂片、染色镜检、氧化酶等试验对被测菌进行初步鉴定，以选择合适的试剂条。3）挑选被测菌的纯菌落接种试剂条第四十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（二）数码分类鉴定系统组成和操作（2）接种1）制备细菌悬液：挑取菌落按试条要求用生理盐水制备菌悬液。2）调整菌悬液浓度：按试条要求调整至1.5亿∕ml（0.5麦氏单位）。3）接种的体积：注意接种后液面要平，不凸起也不凹陷，否则将影响观察结果。第四十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（二）数码分类鉴定系统组成和操作（3）观察及记录结果：接种后的试条经35℃-37℃孵育18h观察结果，并在报告单上记录结果。第四十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（二）数码分类鉴定系统组成和操作（4）结果的解释依据是鉴定百分率表、编码本和电脑软件，可将反应结果直接与百分率表核对而得出结果，或将生化反应的结果按3个一组得出数码，查阅编码本即可得出解释。与电脑联机，可半自动地得到鉴定的结果。第四十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期三ANOXOMATMARKII

厌氧微需氧培养系统

第四十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期三三、微生物鉴定药敏分析系统（一）半自动微生物鉴定和药敏系统，1．VITEK．ATBl）原理：ATB鉴定系统是将肉眼观察的结果输人电脑，计算机数据库由许多细菌条目组成，将输人结果与数据库内细菌条目比较，自动地得到鉴定结果。结果判读为：敏感，中介或耐药。

第四十八页，共八十六页，编辑于2023年，星期三三、微生物鉴定药敏分析系统2）仪器组成由读数仪和电脑两部分组成。电脑软件包括ATB和API的鉴定数据库和ATB的药敏数据库，数据储存、分析系统以及药敏专家系统。第四十九页，共八十六页，编辑于2023年，星期三

3）操作方法：①标本得到纯菌落。②进行初步鉴定选择试剂条。③按试条要求制备菌悬液。④接种试剂条经35℃孵育18小时观察结果。⑤将结果输人电脑，得到鉴定结果。第五十页，共八十六页，编辑于2023年，星期三三、微生物鉴定药敏分析系统4）特点：ATB系统是由API金标准改良而成，拥有庞大的细菌资料库,可鉴定550种细菌。ATB系统操作方便，只需输入培养结果，即可得到结果。第五十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期三三、微生物鉴定药敏分析系统2．MicroscanPanell）原理：使用测试板及快速接种系统，人工判读，将编码结果输人电脑，由电脑软件得出反应结果。2）操作方法：与ATB相似。3）特点：操作简便，价格便宜。第五十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（二）自动微生物鉴定药敏系统1.Autoscan.4自动微生物鉴定/药敏分析仪（1）原理：试剂板在培养箱孵育，然后放主机，用比色法及比浊法对鉴定及药敏（MIC）进行测定，96条不同波长光导纤维同时测定。（2）仪器组成：主机，电脑和打印机。（3）操作方法：将菌液加人试剂板，孵育24小时。放入主机仪器自动判读结果。（4）特点：自动判读结果，操作简便。第五十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期三2．AutoReader

自动微生物鉴定／药敏分析仪（1）原理：用荧光检测技术，在测定板底物中加人酶介物，使其与细菌生长中的酶结合生成荧光物质。荧光物质通过荧光读数仪得出的生物编码来判定菌种。（2）仪器组成：主机，电脑。

第五十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期三2．AutoReader

自动微生物鉴定／药敏分析仪（3）操作方法：将菌液加入试剂板，孵育24小时。将试剂板放入主机仪器自动判读结果。（4）特点：可同进行鉴定和药敏，自动判读结果，操作简便。第五十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（三）全自动微生物鉴定药敏系统1．VITEK系统自动微生物鉴定仪（AMS）可做各种细菌的鉴定和药敏试验，包括各种肠杆菌科细菌，非发酵细菌，革兰阳性球菌，革兰阴性球菌，厌氧菌及酵母菌的鉴定以及对引起尿路感染的9种最常见的细菌鉴定和计数。第五十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（三）全自动微生物鉴定药敏系统（l）原理：采用数码鉴定原理。组成数据库自动打印实验报告和病人报告单。（2）分型：分为Vitek-32，读取32片试验卡。Vitek-60，容纳60片试验卡。Vitek-120，容纳120片试验卡第五十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（3）仪器组成：①充填机／封口机；②读取器／恒温箱；③电脑主机；④终端机；⑤打印机；⑥Vitek120。（三）全自动微生物鉴定药敏系统第五十八页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（三）全自动微生物鉴定药敏系统（4）配套试剂：配套鉴定和药敏测试卡。（5）操作方法：稀释尿标本或准备好的细菌悬液，接种后封闭卡孔，放入读取器／恒温箱，于35℃孵育，每隔一小时读卡1次，于4h内打印出结果。第五十九页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（三）全自动微生物鉴定药敏系统（6）仪器特点：①自动化；②快速，肠杆菌6h。③准确；④报告完整，包括菌名、最小抑菌浓度（MIC）及成人用药剂量。第六十页，共八十六页，编辑于2023年，星期三3．Sensititre全自动微生物鉴定／药敏分析仪（1）原理：①细菌鉴定：利用细菌生长产生酶的特性，加人酶介质，使其与细菌生长中的酶结合生成荧光物质。在较短的时间判定菌种。②药敏试验原理：人工判定时为比浊法，仪器自动判读时为荧光测定法。第六十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期三3．Sensititre全自动微生物鉴定／药敏分析仪（2）仪器组成：①孵育箱及读数仪：同时检测192个菌种样本。自动孵育，读数。②电脑主机：采用最先进稳定的UNIX系统作为操作平台。第六十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期三3．Sensititre全自动微生物鉴定／药敏分析仪（3）反应板：①鉴定板：革兰阴性菌，革兰阳性菌，厌氧菌、苛氧菌及真菌的鉴定板。②药敏板可提供近300种不同组合的抗生素板。（4）操作方法：制备菌液接种，孵育读数。第六十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期三四、微生物自动鉴定药敏分析系统展望微生物鉴定和药敏分析系的要求：①快速鉴定和药敏试验最好能在2－8h内完成。②检测准确率高，能检测一般常规所有细菌，特别是葡萄球菌，非发酵菌和链球菌等,需提高检测的准确率和分辨率。第六十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期三四、微生物自动鉴定药敏分析系统展望③自动化和电脑的智能化程度强，包括条形码识别功能，专家系统和便于网络化的数据分析和储存系统。④成本更低，使中小型医院也能应用。第六十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期三血培养系统1.菌血症是指细菌侵入血循环，并在其中生长繁殖，产生毒素引起的急性全身感染，常导致休克和多脏器衰竭。2.有关的微生物种类多，其毒力、致病性和耐药性各异，更增加了诊断和治疗的复杂性。因此，及时准确地获得结果尤为重要。3.近年来出现自动化、电脑化的智能型血培养系统。第六十六页，共八十六页，编辑于2023年，星期三第六十七页，共八十六页，编辑于2023年，星期三一、血培养系统的发展概况自动血培养检测系统的基础是检测细菌和真菌生长时所释放的二氧化碳来作为有无微生物存在的指标。检测的技术有放射标记、颜色变化和荧光技术等。血培养瓶的种类增加以适应临床的各种需求，有需氧菌、厌氧菌、分枝杆菌、L型菌培养、抗生素瓶等。第六十八页，共八十六页，编辑于2023年，星期三第六十九页，共八十六页，编辑于2023年，星期三

二、仪器的基本结构与性能

(一）主机l．恒温孵育系统，设有恒温装置和震荡培养装置。2．检测系统，自动血培养系统设有相应检测系统。原理：（1）放射性14C标记法：活菌利用标记底物产生14C。BACTEC仪分析培养瓶中气体，14C标记CO2量超过界限时报告阳性生长。第七十页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（2）二氧化碳感受器：每一血液培养瓶底部都含有Novel颜色感应器，当血液培养瓶内有微生物生长释出之CO2后，感应器之酸碱值也跟着改变，从深绿色变为黄色，电脑报告阳性。

第七十一页，共八十六页，编辑于2023年，星期三（3）均质荧光技术：在血培养基内含有发荧光物质。微生物生长代谢过程中产生各种带电荷的原子团，培养瓶发出的荧光，即可检测有细菌存在。判断并发出阴、阳性结果的报告，通过条形码识别标本编号，记录和打印结果。第七十二页，共八十六页，编辑于2023年，星期三

三、配套试剂及操作要点1．培养瓶有需氧培养瓶、厌氧培养瓶等种类。（l）培养基营养成分：分离需氧及兼性厌氧菌时，国内常用酚红肉汤。分离厌氧菌时，在基础培养基中再加人酵母浸膏。（2）抗菌药物桔抗剂：如加硫酸镁桔抗某些抗生素。第七十三页，共八十六页，编辑于2023年，星期三2．真空采血系统配有一次性使用的无菌塑料管，采得的血液因负压作用进入培养瓶。第七十四页，共八十六页，编辑于2023年，星期三3．取血量成人一次采血量为

5-6ml，婴幼儿为1-2ml。4．采血方法应在发热高峰前1小时,或抗菌药物应用之前采集。无菌采集血液后立即注入装有液体培养基的培养瓶中。第七十五页，共八十六页，编辑于2023年，星期三四、常用血培养系统及其性能特点（一）半自动培养仪

专用于快速检测血液、脑脊液，胸水及其他体液中的细菌。1．原理待测标本接种在含14C底物的专用培养瓶中，若有细菌生长，产生14