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文档简介
实验二、植物总RNA的提取实验二植物总RNA的提取一、实验目的:
1.了解真核生物基因组RNA提取的一般原理。2.掌握Trizol提取RNA的方法和步骤。3.了解RNA纯度的检测。
实验二植物总RNA的提取二、一般原理
Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂,在匀浆和裂解过程中,能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后,RNA处于水相中,将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
实验二植物总RNA的提取
Trizol试剂配制
苯酚饱和液(38%)-380ml/L硫氰酸胍盐(0.8M-118.16g)硫氰酸铵(0.4M)--76.12g醋酸钠pH5(0.1M)-33.4ml甘油–50ml加水至1L
。
实验二植物总RNA的提取三、材料
植物组织四、设备
移液器,冷冻高速离心机,低温冰箱,台式高速离心机,液氮罐,陶瓷研钵,1.5ml离心管。
实验二植物总RNA的提取五、试剂
1、无RNA酶的无菌水:用将高温烘烤的玻璃瓶(180℃2小时)装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC(体积/体积),处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇:用DEPC处理水配制75%乙醇,(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱。
3、氯仿:异戊醇[24:1(v/v)]、氯仿。
4、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。
5、Trizol试剂。实验二植物总RNA的提取六、操作步骤1、取植物嫩叶,液氮研磨,每1.5mltube分装0.1克样品;2.每管加入0.5mlTrizol液,迅速混匀,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
3、室温下静置5分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离实验二植物总RNA的提取4、加入0.5ml的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒,室温静置3分钟
5、10000r/min离心5分钟6、取上清液(水相)转入一新的离心管,加入等体积异丙醇,室温放置3分钟,10000r/min离心5分钟。
7、弃去上清液,加入至少1ml的70%乙醇,涡旋混匀,4℃下10000r/min离心5分钟。
实验二植物总RNA的提取8、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于20微升TE或DEPC处理过的水中,必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃实验二植物总RNA的提取七、检测1、DNA的紫外分光光度计检测OD260/OD280>1.81OD260=40μg/mLDNA2、甲醛变性琼脂糖电泳检测实验二植物总RNA的提取实验二植物总RNA的提取八、注意事项(1)Trizol、DEPC等有毒,与皮肤接触会引起伤害。操作过程带手套,在通风条件下操作。(2)避免带入RNase进入样品带手套,别用手碰任何与样品接触的物品。使用新的已灭活RNase的塑料器皿与用具。(3)爱护仪器设备,安全操作实验二植物总RNA的提取作业:1、RNA酶的变性或失活剂有那些?其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种?2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。实验二植物总RNA的提取补充:DNA检测方法1.此外分光光度计检测OD260值=1时,相当于含50μg/mLDNAOD260/OD280=1.8~1.9时,DNA较纯小于1.8时,蛋白含量较高,
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