地中海贫血的研究进展

地中海贫血诊断和治疗的进展中山大学附属第二医院儿科李文益整理ppt第一页，共五十八页。

发病率(含杂合子)：

●全世界约1.5亿人携带血红蛋白病基因

全国：异常血红蛋白0.33%α-地贫2.64%β-地贫0.66%

广东：α-地贫7.3%(9.64%)β-地贫1.83～3.36%(3.54%)

广西：α-地贫14.9%●继发性α-地贫

整理ppt第二页，共五十八页。

遗传学

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α珠蛋白基因簇位于16号染色体上

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β珠蛋白基因簇位于11号染色体上整理ppt第三页，共五十八页。

IVSI

IVSⅡ

16号染色体5’

3’

13132991001415’3’

ζФζФα1α2α1

Kb0102030

整理ppt第四页，共五十八页。

IVSⅠ

IVSⅡ

11号染色体5’3’

13031104105146

5’

3’ψβ2εGγAγψβ1δβkb0102030405060

整理ppt第五页，共五十八页。缺失型α-地贫◆全世界缺失型已达31种◆其中－α4.2(左侧缺失)和－α3.7(右侧缺失)缺失型是遍布全世界的类型，其余突变那么随地理和人群分布的不同而异。◆在我国，除上述二种缺失外，尚有－SEA(缺失20kb)、THAI(缺失31kb)、FIL(缺失30～34kb)和－α2.7等。整理ppt第六页，共五十八页。

非缺失型α-地贫◆目前已报道42种◆包括启动子突变、剪接点突变、移码突变、无义突变、终止密码子突变、核苷酸信号位点改变等◆中国人非缺失型：HbCS终止密码子突变α2TAA→CAAHbQOα2CD125(Lcu→Pro)◆其他：HbDuan，Hbwestmead,HbHekinan,HbH-CD30,HbH-CD31,HbH-CD59

整理ppt第七页，共五十八页。获得性α-地中海贫血●继发于恶性血液病/MDS●机制：◆acquireddeletionofthe-globingeneclusterlimitedtotheneoplasticclone◆morecommonly,inactivatingsomaticmutationsofthetrans-actingchromatin-associatedfactorATRX,whichcausedramaticdown-regulationof-globingeneexpression.整理ppt第八页，共五十八页。

β-地贫◆以点突变为主，少数为缺失所致◆全世界报告突变类型>170，中国28种◆中国常见类型：(9省区检测资料)CD41-42(41.6%)、IVS-Ⅱ-654(21.8%)CD17(18.0%)、TATA-nt-28(8.0%)CD71/72(+A)(3.9%)、TATA-29(1.2%)CD26(HbE)整理ppt第九页，共五十八页。诊断※临床表现★β地贫：◆轻型常无临床病症或轻微贫血。◆重型患者在婴儿期出现慢性进行性贫血、轻度黄疸〔间歇性〕、肝脾肿大；常有发育不良和骨骼改变，出现地中海贫血面容。◆中间型多在幼儿期出现贫血，其病症比重型轻。整理ppt第十页，共五十八页。★α地贫：◆静止型无临床病症，◆轻型常无临床病症或轻微贫血。◆中间型〔HbH〕多在幼儿期或以后出现贫血、黄疸、肝脾肿大；感染常使贫血加重甚至出现溶血危象。◆重型多出现死胎或胎儿水肿综合征。整理ppt第十一页，共五十八页。※实验室检查★血象：贫血为小细胞低色素性，MCV＜80fl，MCH＜28pg，MCHC＜32%。网织红细胞正常或增高。外周血细胞涂片染色示红细胞大小不等，中央浅染色区扩大，出现异型、靶形、碎片红细胞和有核红细胞、点彩红细胞、嗜多染性红细胞、豪-周小体等。整理ppt第十二页，共五十八页。★地贫筛查：◆地贫5项：①溶血度〔脆性〕，正常值：＞60%；②HbF；③Hb电泳：HbA2,HbH；④红细胞形态〔参见上〕；⑤ZPP，以排除缺铁性贫血◆地贫6项：：①溶血度〔脆性〕；②Hb电泳；③HbF；④HbA2；⑤MHb；⑥G6PD活性。整理ppt第十三页，共五十八页。

※α-地贫的基因诊断★缺失型：◆

Southern印迹杂交—限制性酶谱分析法：

主要用于较大片段缺失◆PCR法：

▲跨越断裂点的PCR扩增法(gap-PCR)：

可诊断、区分α地贫1纯合子和杂合子▲由gap-PCR衍生的多重PCR：一次PCR扩增能够明确缺失突变形成的各种α地贫基因型或临床类型。整理ppt第十四页，共五十八页。★非缺失型◆Southern印迹杂交诊断法◆PCR-酶解法：◆扩建酶切点法：◆PCR-ASO◆其他方法：聚合酶链反响结合单链构象多态性分析〔PCR-SSCP〕和变性梯度凝胶电泳〔DGGE〕也曾用于α地贫点突变的基因分析，一般多用于点突变的研究而不是基因诊断和产前诊断。整理ppt第十五页，共五十八页。※β-地中海贫血的基因诊断◆PCR结合ASO探针斑点杂交技术◆扩增不应突变系统法〔ARMS法〕◆DNA芯片技术〔DNAchip〕◆反向点杂交〔Reversedotblot,RDB〕整理ppt第十六页，共五十八页。β-地贫的鉴别诊断

与小细胞低色素性贫血的鉴别●缺铁性贫血●感染或炎症性贫血●肺含铁血黄素沉着症●铁粒幼红细胞性贫血●铅中毒●铜缺乏●先天性转铁蛋白缺乏症整理ppt第十七页，共五十八页。※缺铁性贫血

●多于6月~2岁发病，无家族史●不当喂养史●无溶血证据，网织红N/↓●SI、TS、SF↓TIBC、FEP↑●骨髓内、外铁减少整理ppt第十八页，共五十八页。※慢性感染性贫血

●有感染、炎症史及相应临床表现

●贫血有时仅为小细胞性

●无溶血，网织红N/↓

●SI、TIBC、TS↓，SF、FEP↑

●铁粒幼细胞↓，外铁↑

整理ppt第十九页，共五十八页。※铁粒幼红细胞性贫血

●顽固贫血，铁剂治疗无效，个别病例母系B6治疗有效

●无溶血，网织红N/↓

●BM、外铁↑，铁粒幼红↑，可见环状铁粒幼红细胞●SI、SF、FEP↑、TIBCN/↓整理ppt第二十页，共五十八页。※肺含铁血黄素沉着症●发作性苍白，无力，咳嗽，痰中带血●X线胸片肺野中可见网点状阴影●痰和胃液中可找到含铁血黄素细胞●小细胞低色素性贫血，网织红↑●SI、TS↓、TIBC↑●SR↑整理ppt第二十一页，共五十八页。※铅中毒

●红细胞中可见嗜碱性点彩

●长骨X线改变

●FEP↑↑※铜缺乏性贫血

●脂溢性皮炎，皮肤毛发色素少浅表静脉扩张，自发性骨折精神障碍

●贫血、WBC↓，血铜蓝蛋白↓整理ppt第二十二页，共五十八页。※转铁蛋白缺乏症●自幼贫血，1岁时贫血严重●肝脾轻度大，铁剂治疗无效●网织红↓，BM内、外铁↓●SI、TIBC、TS、SF↓※其他：Coombs阴性自溶整理ppt第二十三页，共五十八页。

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地中海贫血的预防

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人群普查

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遗传咨询

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产前诊断整理ppt第二十四页，共五十八页。

治疗

★红细胞输注和去铁治疗●本疗法仍是最根本治疗方法●高、中量输血配合铁螯合剂●能活到成年并到达正常人的生活能力缺点：需终身治疗，费用昂贵易出现输血副反响，尤其是输血传染病等整理ppt第二十五页，共五十八页。红细胞输注①低量输血法：目前已不用此法

②中量输血法(moderatetransfusion)维持输血之前的Hb浓度＞90～105g/L

③高量输血法(hypertransfusion):维持输血前Hb＞100g/L

④超量输血法(supertransfusion)：维持输血前Hb＞120g/L整理ppt第二十六页，共五十八页。红细胞输注

●每次输浓缩红细胞10～20ml/kg,每2～4周1次●使输注后Hb浓度达130～135g/L●无论何种方法，每次输注之后Hb不能超过150g/L●浓缩红细胞输注速度应＜4～5ml/〔kg·h〕●重度贫血者输注的速度应更慢＜2ml/kg·h〕整理ppt第二十七页，共五十八页。去铁治疗

铁螯合剂去铁胺(deferoxamine,DFO)过早使用〔＜１岁〕可产生骨骼畸形、生长抑制等副作用，在规那么输血１年或输红细胞10～20单位之后进行铁负荷的评估整理ppt第二十八页，共五十八页。铁负荷的评估方法：

①测定血清铁蛋白(SF),简便可行，但影响因素较多；②肝穿刺后测定肝组织的铁含量，此法较准确,但属损伤性检查，一般医院难于实行；③

影像学方法如MRI，此法虽简便但准确度不够且费用高如有铁超负荷，那么开始使用铁螯合剂(>3.2mg/g干肝组织或血清铁蛋白＞整理ppt第二十九页，共五十八页。DFO剂量

●20～60mg/kg.d，每周应用5～6天●长期应用以控制铁蛋白在1000～2000μg/L之间为理想，采用连续皮下注射12小时，或持续静脉滴注8～12小时等方法●缺点是使用较麻烦,病儿依从性差，如使用不当(铁负荷轻而用大剂量DFO〕,可致白内障、听力丧失、长骨生长障碍等副作用整理ppt第三十页，共五十八页。口服铁螯合剂※deferiprone(L1)●化学名羟基吡啶1，二齿状分子结构●以3:1与Fe3+结合，结合效率差些●吸收快，迅速转化成活性形式，排泄快●1984年临床实验，1995年上市(卬度)●常用量75mg/kg.d●短期疗效较差，长期疗效仍有争议●副作用：关节痛、(常见)粒细胞减少(严重)、锌缺乏、胃肠反响、肝功能异常整理ppt第三十一页，共五十八页。※ICL670●三齿状分子结构三氮唑化合物●以2:1与Fe3+结合●吸收快，在血循环中存活几小时●效果为DFO的5倍，L1的10倍●剂量20mg/kg.d●副作用：胃肠反响，皮疹。肝肾功能无影响。动物实验肾小管上皮细胞有改变(非铁超负荷)整理ppt第三十二页，共五十八页。造血干细胞移植〔HSCT〕●是目前能够根治重型β地贫的一种治疗方法●HSCT分为骨髓移植(BMT)、脐血移植(UCBT)和外周血干细胞移植〔PBSCT〕●胎儿期予HSCT:宫内造血干细胞移植(IUSCT)整理ppt第三十三页，共五十八页。BMT治疗重型β地贫

●1982年首例成功●至今全世界应用已达1000余例●长期生存率达80％●供体来源困难，费用昂贵血整理ppt第三十四页，共五十八页。UCBT治疗重型β地贫

●1989年首例UCBT治疗范可尼贫血成功●1995年泰国治疗HbE／β地贫获得成功●1998年1月中山二院在内地开展首例●不少医院开展，总数已超过100例●由血缘相关开展至无血缘相关●HLA位点由全相合开展至1～3个位点不合整理ppt第三十五页，共五十八页。异基因外周血干细胞移植(Allo-PBSCT〕

●1989年治疗1例慢性白血病取得成功，血细胞别离机从外周血可采到足够的造血干细胞供者无需麻醉，平安●PBSCT治疗地贫国外从1996年开始，香港1998报告３例，内地1999年中山二院首例，各地陆续开展整理ppt第三十六页，共五十八页。宫内造血干细胞移植

●国外于1996年开始报告，但至目前仅数例●国内尚未开展整理ppt第三十七页，共五十八页。基因治疗

★根治性基因治疗〔基因矫正治疗〕●基因矫正治疗是把正常的目的基因导入体内，并到达适当、有效、持久的表达，以完全取代原来的病态基因●β地贫是β珠蛋白基因的单基因缺陷遗传病，理论上是基因治疗最理想的模型●1984年开始基因治疗的研究，进展缓慢，其原因之一是载体问题，二是转导的β珠蛋白基因片段的大小。整理ppt第三十八页，共五十八页。★β珠蛋白基因族●非常庞大，调控也非常复杂●β珠蛋白基因组●上游基因调节元件即位点调控区(locuscontrolregion,LCR)的DNase敏感〔hypersensitive,HS〕片段〔包括HS2、HS3、HS4〕对转导后的基因表达非常重要。整理ppt第三十九页，共五十八页。★逆转录病毒载体●常用癌瘤逆转录病毒〔onco-retroviralvector〕携带β珠蛋白基因及其调节元件●将人珠蛋白基因导入小鼠红白血病(MEL)细胞进行培养,可成功表达β珠蛋白●在小鼠动物模型上将β基因通过逆转录病毒载体转染鼠造血干细胞,在受体红细胞中获得表达。将人β珠蛋白基因导入β地中海贫血小鼠体内,其病症可获得局部改善整理ppt第四十页，共五十八页。逆转录病毒载体有如下缺点：①载体的容量有限〔仅7kb左右〕，无法完全包含β珠蛋白基因组及其上游LCR片段，因而表达效价低和不稳定；②不能转染静止期细胞；③病毒随机插入靶细胞的基因组中可使插入点附近的基因表达失控，插入的基因也有可能不恰当的表达；④病毒可能感染宿主；⑤致癌作用，动物实验已发现淋巴瘤发生。整理ppt第四十一页，共五十八页。慢病毒〔lentivirus〕载体●优点是：①载体容量大，能包含大片段的β珠蛋白基因组及其上游调节元件，保证β珠蛋白基因的高效、稳定表达；②可以转染静止期细胞,并能永久表达。●常用的是HIV-1为根底的慢病毒载体。整理ppt第四十二页，共五十八页。2000年MayC等首次应用携带有大片段的调节序列的人的β珠蛋白基因慢病毒载体转染小鼠骨髓细胞，人的β珠蛋白基因有效、准确的整合到宿主DNA中，并能高效表达，合成正常血红蛋白可达17-24%，到达治疗β地中海贫血小鼠的目的。文章发表在Nature整理ppt第四十三页，共五十八页。Pawlin等〔2001〕、Imrens等〔2002〕、Persons等〔2003〕、Levasceur等〔2003〕、Rivella等〔2003〕报告采用同样载体，在中间型β地贫鼠〔Hbbth3/+〕模型中显示每拷贝载体可使Hb增加1.1～2.3g/dl，血液参数明显纠正,红细胞形态明显好转。整理ppt第四十四页，共五十八页。●以上用的Hbbth3/+鼠为中间型鼠●为了更接近人重型β地贫，Rivella等建立了重型β地贫鼠模型。这种鼠如不治疗将在6～8周内死于严重贫血〔Hb2～3g/dl〕●用上述载体基因转导后那么转变为中间型地贫鼠。由此提示治疗人重型β地贫时，采用这些载体转导β或γ珠蛋白基因还需要更高的表达。整理ppt第四十五页，共五十八页。位点独立性表达〔positionindependentexpression〕：在鼠的研究中还发现一个特征，尽管包含了β或γ珠蛋白基因的调节元件，但β或γ珠蛋白的表达在不同的鼠之间差异很大鸡HS4(cHS4)具染色质隔离成分〔chromatininsulatorelement〕，在癌瘤逆转录病毒载体中已发现可减少位点作用差异〔positioneffectvariegation,PEV〕cHS4元件具有阻断增强子活性作用，可能有较好的载体生物平安性，对克服载体的致癌作用很重要。整理ppt第四十六页，共五十八页。Puthenveetil等报告采用慢病毒载体，所包含的β珠蛋白基因族中参加cHS4染色质隔离成分,修正后的人β地贫CD34＋细胞在细胞培养中得到一致的红系分化和纠正异常的β地贫特征，移植入免疫缺陷鼠后，3～4个月后仍是红系正常分化。整理ppt第四十七页，共五十八页。基因调控治疗

●是广义的基因治疗●机理是根据β地贫的病理生理根底是α链和非α链合成速率的不平衡，药物来激活非α链珠蛋白基因的功能，增加非α链珠蛋白的合成速率；或抑制α珠蛋白基因功能，降低α珠蛋白的成速率的合成速率；减轻α和非α珠蛋白的失衡程度减轻临床病症整理ppt第四十八页，共五十八页。基因调控治疗主要有：

①

药物基因调控治疗；②

反义核酸性基因调控治疗；③

造血生长因子治疗。④中药治疗整理ppt第四十九页，共五十八页。药物基因调控治疗1982年首先报告应用５-氮胞核苷许多药物，如羟基脲、丁酸盐、阿糖胞苷、马利兰、雷米封等都有研究报告羟基脲〔HU〕的研究报告最多，效果也较好整