生物化学实验-9个-课件

生物化学实验36学时植物组织中还原糖和总糖的测定醋酸纤维素薄膜电泳Vc的测定琥珀酸脱氢酶的作用和竞争性抑制作用牛奶中酪蛋白的提取与鉴定血液中葡萄糖的测定植物组织中DNA的提取双缩脲测定蛋白质的含量酶的性质实验内容一、分组说明每班分2大组，每个大组（再分2或3小组）中2人一个实验,大组采用循环实验的方法,同时开出不同的9个实验.四、预习好之后方能进入实验室做实验（流程图或方框图），做好实验记录二、注意实验室卫生、纪律和安全三、实验报告的书写（统一）目的、原理、步骤、结果及结论、讨论植物组织中DNA的提取与鉴定血液中葡萄糖的测定植物组织中还原糖和总糖的测定Vc的测定琥珀酸脱氢酶的作用和竞争性抑制作用酪蛋白的提取与鉴定酶的性质双缩脲测定蛋白质的含量醋酸纤维素薄膜电泳

1班2班第一组实验第二组实验第三组实验第四组实验第一次实验第一组学生第二组第三组第四组第二次实验第二组学生第一组第四组第三组第三次实验第三组学生第四组第一组第二组第三次实验第四组学生第三组第二组第一组生物化学所用的实验技术

1.样品:

动物样品:血清、牛奶、组织

植物样品：果实、叶、茎等为了提取物质，需匀浆，研磨开始时加入少量研磨缓冲液，边磨边加。2．移液管的使用：

注意：移液管吸管移液管读数拿的姿势取液放液3．离心机的使用：平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停4．分光光度计机器原理和测定原理（比尔定律）5．水浴锅的使用实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响一、目的：了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响

二、实验原理

酶的本质是蛋白质，蛋白易变性

唾液淀粉酶可将淀粉分解成各种糊精、麦芽糖等产物检测水解：可以用遇碘呈不同颜色来观察。淀粉遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。

三、实验步骤1、淀粉酶液的制备水漱口制备。2、温度对酶活性的影响试管号0.5%淀粉溶液稀释酶液温度现象1235ml5ml5ml1ml1ml1ml0℃水浴37℃水浴沸水浴做咀嚼动作1~2min

在白色比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔1分钟，从第二管中取出反应液1滴与碘混合，观察颜色变化。待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化（即只呈碘的颜色）时，向各管中加入碘液1滴，摇匀，观察并记录各管颜色，说明温度对酶活性的影响。或在各自温度下保温10min3、pH对酶活性的影响试管号0.5%淀粉溶液稀释酶液pH现象1232ml2ml2ml10d10d10dpH5.0pH6.8pH8.0每隔1分钟，从pH6.8管中取出反应液1滴与碘混合，观察颜色变化。或在37℃,保温10min4、酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响试管号0.5%淀粉溶液1%CuSO4溶液0.5%NaCl溶液蒸馏水稀释唾液结果1232ml2ml2ml1ml0001ml0001ml1ml1ml1ml分析5、酶的高效性

试管号H2O2生马铃薯熟马铃薯铁粉结果12343ml3ml3ml3ml少许00－0少许0－00少许－分析本实验注意事项：加入所有的试剂和酶液后一定要摇匀，最好用吸管轻轻吹打几次。稀释唾液加入时应迅速，其中放入沸水浴的一管，当唾液加入后应立即放入沸水浴。实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定

一、实验目的

学习从牛奶中制备酪蛋白的方法并进行鉴定试验二、实验原理

蛋白质等电点沉淀牛乳和羊乳中含丰富的蛋白质，其中主要是酪蛋白。酪蛋白在羊乳中约占总蛋白量的3/4，牛乳中约占总蛋白量的5/6。酪蛋白是酸性蛋白，在中性偏碱的环境中，溶解性最高，而在酸性条件下溶解性差，等电点时最低。将牛乳的pH调整至4.8，即酪蛋白的等电点时，酪蛋白即沉淀出来。用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪，得到纯的酪蛋白。所得酪蛋白供定性鉴定。鲜牛乳2Oml（40℃）+2Om醋酸缓冲液（40℃）边加边摇动离心3000r/5min冷却至室温，继续放置5分钟清液（乳清）沉淀加热观察现象

醇醚混合物洗1-2次沉淀清液晾干，鉴定弃掉三、实验步骤1、酪蛋白的制备2、酪蛋白的性质鉴定

1）.溶解度观察溶液H2O10%NaCl0.5%Na2CO30.1MNaOH

0.2%HCl饱和Ca(OH)2试剂量2ml2ml2ml2ml2ml2ml酪蛋白少许少许少许少许少许少许溶解情况

2）米伦反应：

少许酪蛋白+lmlH2O+米伦试剂10滴，振摇，加热观察其颜色变化3）含硫(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)测定:少量酪蛋白+lmlO.1MNaOH+5%醋酸铅1-3滴

观察现象煮沸注意事项牛奶和醋酸缓冲液体积一定要相等注意离心时要对角配平实验三血液葡萄糖的测定

一、实验目的

学习和掌握Folin-吴宪法测定血糖的方法二、实验原理G＋Cu2+碱性氧化亚铜磷钼酸

＋钼蓝

420nm处有大吸收峰三、实验步骤样品：钨酸法制备1：10全血无蛋白滤液(相当于将原血稀释了10倍)。

2、反应血糖试剂（ml）空白管低浓度标准管高浓度标准管测定管无蛋白血滤液蒸馏水标准葡萄糖液碱性铜试剂—2.0—2.0—1.01.02.0——2.02.0

1.01.0—2.0混匀，置沸水浴中煮8分钟，取出，用流动的自来水冷却3分钟（切勿摇动血糖管）磷钼酸试剂反应3min后，振摇将气体排净

2.0

2.0

2.0

2.01：4磷钼酸溶液加至25252525OD4202、计算

测定管光密度100

×0.2×=葡萄糖mg/100ml

标准管光密度0.1高标准管：低标准管：

×0.1×=葡萄糖mg/100ml

标准管光密度0.1测定管光密度100标准葡萄糖应用液的浓度为0.1mg/mL注意事项一定要等水沸后，再放人血糖管。血糖管可用橡皮筋扎成束，直立水中使受热一致。加热要准确8分钟，时间过久，呈色较深;时间不足。颜色过浅。均影响结果的准确性。冷却时，切不可摇动血糖管，以防还原的氧化亚铜被空气中氧所氧化，降低实际结果。用1：4磷钼酸溶液加至25刻度处后，用橡皮塞塞紧管口颠倒摇匀，用空白管调零，在420nm波长处进行比色，实验四、血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳

一、实验目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作技术，了解电泳技术的基本原理。二、实验原理电泳：带电粒子在电场中泳动的现象。电泳迁移率:单位电场下的电泳速度。血清蛋白:清蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白和各种脂蛋白等三、实验步骤

浸泡：20分钟点样:吸干，无光泽面朝上，在膜条一端2-3厘米处点样品。电泳：点样端在负极,2mA/膜,点样面向下时间60min染色:5min漂洗:2次，底色脱净为止实验五双缩脲测定蛋白质含量一、实验目的

掌握双缩脲测定蛋白质的方法和原理二、实验原理

双缩脲在碱性溶液中与Cu2+产生紫色的络合物,这一反应称“双缩脲反应”。蛋白质分子中肽键，也能与Cu2+

发生双缩脲反应，溶液紫色的深浅与蛋白质含量在一定范围内成正比，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关。该紫色的络合物在540nm处有最大吸收值，通过测定540nm处的吸光值用于蛋白质含量的测定。三、实验步骤1、标准曲线制作（已制好）2、样品测定试管号血清稀释液H2O双缩脲试剂OD540nm空白样品1样品20ml0.5ml0.5ml1ml0.5ml0.5ml4ml4ml4ml3、结果计算

实验六维生素C的定量测定

（2，6-二氯酚靛酚滴定法）

一、实验目的掌握滴定法测定Vc含量的原理和操作。二、实验原理

还原型Vc能还原染料2,6-二氯酚靛酚钠盐，2,6-二氯酚靛酚在酸性溶液中，呈红色，被还原后变为无色。所以，滴定液呈淡红色30秒不退色，即为终点。用标准Vc滴定与样品做比对。三、实验步骤1.提取:2.0克松针+少量2%草酸

匀浆

3500rpm，10min离心后用2%草酸定容到50毫升

2、滴定（1）标准液滴定：准确吸取标准抗坏血酸溶液10毫升（含1.0毫克抗坏血酸）置100毫升锥形瓶中，用滴定管以0.1%2，6一二氯酚靛酚滴至淡红色出现，保持15秒钟不退色即为滴定终点;由所用染料的体积计算出1毫升染料相当于多少毫克抗坏血酸。(2)样液滴定:准确吸取滤液两份，每份10毫升分别放人100毫升锥形瓶内，滴定方法同前。空白滴定：准确吸取10毫升2%草酸溶液，放入100毫升锥形瓶中，用上述方法滴定至终点，记录所用染料体积（草酸溶液有一定的还原性，但很弱，计算可忽略不计）。3、计算计算1000克样品所含维生素C的毫克数。（V1－V2）×K×VX= ×1000W×V3式中：X：1000克样品所含维生素C毫克数W：称取样品重量毫克数V1：滴定样品所用染料毫升数V2：滴定空白所用染料毫升数V3：样品测定时所用滤液毫升数（即10毫升）V：样品提取液稀释至总体积（即50毫升）K：1毫升染料所能氧化维生素C之毫克数，可由标定算出。注意事项选择样品尽量选择绿色的新鲜的松针滴定过程宜迅速，一般不超过2分钟。实验七植物组织中还原糖和总糖的含量测定一、实验目的掌握比色测定还原糖和总糖测定的基本原理和操作。二、实验原理

植物总糖非还原糖：还原糖：单糖、麦芽糖，可用水溶液提取。蔗糖和淀粉，可用酸水解后为还原糖还原糖碱性3，5－二硝基水杨酸糖酸及其它产物

3－氨基－5－硝基水杨酸（棕红色）540nm有强吸收水解加了n个水三、实验步骤1、总糖的测定0.5g面粉+10ml

6NHCl+15mlH2O煮20min，取2d加碘－碘化钾溶液检测是否完全水解（水解不显蓝）加1d酚酞，用6NNaOH调至微红，定容到100ml，混匀，过滤，稀释10倍后待测。2、还原糖的测定1.5g面粉+少量H2O混匀+50mlH2O50℃，20min，4000rpm,10min取上清，20ml洗渣，合并上清，定容到100ml，混匀，过滤，待测。3、总糖和还原糖的测定还原糖还原糖总糖总糖空白(水)测定液（ml）221103，5－二硝基水杨酸（ml）1.51.51.51.51.5H2O00112煮5min，取出立即放入冷水，冷却后定容到20ml，混匀，测定OD540nm,对标准曲线查还原糖的量。OD540nm4、计算还原糖％=提取体积测定体积×100％样品毫克数标准曲线得到还原糖的量×总糖％=标线得到还原糖的量提取体积测定体积样品毫克数××稀释倍数×100％×0.9实验八琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察一、实验目的了解琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制剂对其活性的抑制。二、实验原理琥珀酸脱氢酶延胡索酸琥珀酸甲烯蓝

甲烯白

FADFADH2无氧丙二酸－三、实验步骤1、酶的制备猪心1.5～2g+1/15M磷酸氢二钠溶液3～4ml

匀浆1/15M磷酸氢二钠溶液6～7ml,放置30min2000r/min离心10min,取上清备用.2、酶促反应试管号酶液(滴)琥珀酸钠溶液丙二酸钠溶液蒸馏水甲烯蓝溶液石蜡油

现象变化37℃,30min内)15d5d-25d2d10d25d煮沸5d-25d2d10d35d5d5d20d2d10d45d25d5d0d2d10d或将反应体系放大1-2倍实验九植物组