第7章-革兰阳性球菌课件

兽医微生物学第7章革兰阳性球菌第一节葡萄球菌属第二节链球菌属第三节肠球菌属第四节蜜蜂球菌属革兰阳性球菌球菌种类很多，按革兰染色特性分为革兰阳性球菌和阴性球菌两大类，兽医临床上重要的是革兰阳性球菌，其中的葡萄球菌属和链球菌属的某些成员是人和动物的重要致病菌。第一节葡萄球菌属一、属的特征：

1、葡萄球菌分布广泛:空气、饲料、饮水、地面及物体表面。人及畜禽的皮肤、粘膜、肠道、呼吸道及乳腺中。2、致病性葡萄球菌常引起各种化脓性疾患、败血症或脓毒败血症。当污染食品时，可引起食物中毒。3、圆形，直径0.5-1.5µm，排列成葡萄状（如图）；无芽胞、无鞭毛，有的可形成荚膜或粘液层。4、需氧或兼性厌氧，可在普通培养基中生长，但不能在麦康凯培养基中生长。最适温度35-40℃，最适pH为7.0-7.5。5、致病性菌株多能产生脂溶性的黄色或柠檬色，不着染培养基。6、分类（1）按产生色素颜色：金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌。（2）1974年葡萄球菌属分：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌。（3）《伯吉系统细菌学手册》将本属细菌分为37种，许多种内还分亚种。常见的动物致病菌有金黄色葡萄球菌、猪葡萄球菌、中间葡萄球菌、伪中间葡萄球菌及海豚葡萄球菌。二、金黄色葡萄球菌常见的致病菌多为金黄色葡萄球。1.培养及生化特性

在普通琼脂平板形成湿润、光滑、隆起的圆形菌落，直径1-2mm，有时可达4-5mm。菌落颜色依菌株而异，初呈灰白色，继而为金黄色。在血液琼脂平板形成的菌落较大，产溶血素的菌株多为病原菌，在菌落周围呈现明显的β溶血。2.抗原及变异

葡萄球菌细胞壁上的抗原构造比较复杂，含有多糖及蛋白质两类抗原。多糖抗原

具有型特异性，可分为11个型，临床分离多为5型和8型。蛋白抗原

人源菌株都含有葡萄球菌蛋白A(SPA)，来自动物源菌株则少见。SPA能与人、猴、猪、犬及几乎所有哺乳动物的免疫球蛋白的Fc段结合，结合后的IgG仍能与相应抗原特异性反应。用于免疫学及诊断技术（协同凝集试验）。SPA与IgG结合形成的复合物在机体内具有生物学作用（趋化性、抵抗吞噬、损伤血小板等）。3、抵抗力及药物敏感性

在无芽孢菌中，葡萄球菌的抵抗力较强。在干燥的脓汁或血液中可存养2-3个月，80℃30min才能杀死。对龙胆紫、洗必泰、消毒净、新洁尔灭、度米芬等敏感。对磺胺类、青霉素、金霉素、红霉素、新霉素等抗生素敏感，但易产生耐药性。

4、致病性及毒力因子

金色葡萄球菌可产生多种毒素和酶，故致病性强。常引起化脓性疾病（创伤感染、脓肿、乳腺炎、败血症、脓毒败血症等）及毒素性疾病（被葡萄球菌污染的食物或饲料可引起人或动物的食物中毒性疾病）。毒力因子：葡萄球菌蛋白A、荚膜、毒素及酶。

α毒素

α溶血素，与牛羊的坏疽性乳腺炎有关，它还导致白细胞等崩解。α毒素是不耐热的蛋白质（外毒素），对多种哺乳动物红细胞有溶血作用，而从动物分离的菌株常见β溶血素。

作用原理：毒素分子插入红细胞的细胞膜疏水区，形成微孔，造成红细胞溶解，属于穿孔毒素。

肠毒素

引致人类食物中毒，刺激呕吐中枢，表现呕吐、腹泻。肠毒素是结构相似的一组蛋白质，耐热抗酸，能经受100℃30min或胃蛋白酶的水解根据抗原性差异可以将其分为20多个血清型，A、B两型是引起食物中毒的常见血清型，其次是D型。凝固酶

多数致病株能同时产生两种凝固酶，一种分泌于菌体外（游离凝固酶）。另一种结合在菌体表面（结合凝固酶），它们能使含有抗凝剂的家兔或人的血浆凝固，称为凝固酶。凝固酶耐热，经100℃30min或高压灭菌仅降低少量活性。

作用：保护菌株，有助致病菌株抵御宿主体内吞噬细胞和杀菌物质的作用，同时也使感染局限化。检测葡萄球菌的凝固酶是鉴别菌株的重要指标，致病株多数为凝固酶阳性。

另外还有耐热核酸酶、溶纤维蛋白酶、透明质酸酶，又称为扩散因子。5.微生物学诊断（1）涂片染色镜检

取脓汁、渗出液、乳汁、血液，中毒症取剩余食物等。将病料涂片染色镜检。如发现有大量典型的葡萄球菌课初步诊断。（2）分离培养鉴定

将病料划线接种于5％绵羊或兔血液琼脂平板，37℃培养18-24h，菌落金黄色，周围呈溶血圈者多为致病菌株。进一步鉴定还要做凝固酶试验、分解甘露醇试验，阳性者多为致病菌。必要时可做动物试验。

第二节链球菌属

链球菌种类多、分布广。有些可致人或动物的各种化脓性疾病、肺炎、乳腺炎、败血症等。一、分类

按溶血性分为α、β、γ3类。在鉴定链球菌的致病性方面有一定的意义。

α型溶血链球菌

在菌落周围形成不透明的草绿色溶血环，红细胞未完全溶解，血红蛋白变成绿色。此菌致病力不强，多为条件性菌。

β型溶血链球菌

菌落周围形成完全透明的溶血环，红细胞完全溶解。这类菌致病力强，常引起人及动物各种疾病。

γ型溶血链球菌

菌落周围无溶血现象。一般为非致病菌。二、形态与染色

链球菌呈圆形或卵圆形，直径小于2.0µm，常排列成链状或成双。肉汤内对数生长期的链球菌常呈长链排列，革兰氏阳性，多有荚膜。三、培养及生化特性

多为兼性厌氧菌，少数为厌氧菌。致病菌营养要求较高，普通培养基中生长不良，需添加血液、血清、葡萄糖等。在血液琼脂平板上长成直径0.1-1.0mm，灰白色，表面光滑，边缘整齐的小菌落。多数致病菌株有溶血性。血清肉汤中初呈均匀浑浊，后呈颗粒状沉淀，上清透明。（实验课培养的大肠杆菌的菌液）菌膜菌沉淀均匀浑浊对照四、致病性

致病性链球菌可产生多种毒素或酶，可致人及多种动物的很多疾病，化脓感染、肺炎、乳房炎等。溶血素

分为对氧敏感溶血素O(SLO)和对氧稳定溶血素S(SLS)两种，呈溶血性。致热外毒素

旧名红疹毒素，主要由A群链球菌产生，致人猩红热，小剂量皮内注射家兔可引起局部红疹，大剂量注射可致全身红疹。其他

不同致病菌株，可产生链激酶（溶纤维蛋白酶），透明质酸酶等，其性质作用类葡菌。

细胞壁上的脂磷壁酸(LFA)与菌体吸附于宿主黏膜有关。其荚膜成分、M蛋白等具有抗吞噬作用。五、抵抗力

本属细菌的抵抗力不强。对青霉素、磺胺类药物敏感，易产生耐药性。六、免疫性

链球菌的抗原结构比较复杂，机体感染后有多种抗体产生，已知抗M蛋白的抗体具有保护作用，M蛋白有多种抗原型，各型间缺乏有效的交叉保护。我国研制的猪、羊链球菌疫苗有一定的免疫效果。

七、微生物学诊断

病料（脓汁、乳汁、血液、组织）涂片染色镜检，见革兰氏阳性、具荚膜、成对或链状排列的球菌，可作初步诊断。确诊需用血液琼脂平板分离培养，观察菌落、溶血等特征，并进行生理生化试验。用群、型特异性血清作血清学试验，对病原菌定群或定型。溶血性链球菌八、主要致病菌（一）无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌：三种链球菌是牛、山羊和绵羊的急性、慢性乳腺炎的病原菌之一，其中最常见的是无乳链球菌。形态及染色特性三者形态相似，直径0.5-1.0µm。均无荚膜，革兰阳性。无乳链球菌常呈长链停乳链球菌形成中等长度的链乳房链球菌的链较短，有时成对排列抵抗力及药物敏感性对热、干燥及消毒药的抵抗力不强。对青霉素、红霉素等抗生素及磺胺类等药物均敏感。致病性及免疫性引致牛、山羊和绵羊的急性、慢性乳腺炎，其中最常见的是无乳链球菌。感染后，三种菌均不产生明显的免疫，目前也无可靠的多价菌苗。微生物学诊断取少量乳汁或其离心沉淀物涂片、染色、镜检，如发现链球菌及大量的白细胞，可作出初步诊断。需通过生化实验做进一步的鉴定。(二)猪链球菌：是猪链球菌病的重要致病菌，并可感染人而致死。1、血清型：按荚膜抗原的差异分为35个血清型，包括1－34和1/2，猪链球菌2型是其中毒力最强、最常见的一种，猪链球菌1型、7型及9型也可使猪发病死亡。2、致病性：表现败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎和突然死亡。猪链球菌2型在猪群中通常通过口鼻感染，在扁桃体中增殖，还可存在于母猪的子宫或阴道中，携带猪链球菌2型的猪对其它猪具有传染性。3、毒力因子

猪链球菌2型的溶菌酶释放因子（Muramidase-releasedproteinMRP）、胞外因子（ExtracellularfactorEF）、荚膜多糖抗原（CapsularPolysaccharidebiosynthesislocuscps）和溶血素等是主要的毒力因子。其中，荚膜多糖还是猪链球菌的型特异性抗原，据此可将猪链球菌分为35个血清型。猪链球菌2型cps2J基因仅可以与2型与1/2血清型产生杂交。显示cps2J基因为猪链球菌2型的特异性基因，可以作为鉴定猪2型链球菌的依据。4、我国流行情况

我国于1991年在广东省首次证实该病的存在；1998年和1999年夏季分别在江苏部分地区猪群中爆发，并导致特定人群的25人感染，致死1人；2005年夏季，在四川省资阳、内江等8地市21个县市区爆发，致死猪只647头，感染发病人数为204，其中致死38人。

4、微生物学诊断：（1）取样：安全问题：a)

在标本采集过程中，注意使用一次性隔离服、手套、防护口罩等防护措施。b)

在标本采集过程中,严格采取防护措施，防止针头等锐器刺伤。准备工作：a)

无菌、封闭性好的试管。b)

可以清楚标记且标记不易脱落的记号笔。c)

样品采样记录表。d)

采集组织标本的无菌容器。e)

无菌的剪刀、镊子和手术刀。f)

血平皿(或者使用血培养瓶)。（2）样品的处理：将采集的样品接种于高葡萄糖肉汤培养基中，37℃培养6h。取培养液1mL，12000r/min离心3min，去掉上清。用200µL灭菌双蒸水充分重悬菌泥，100℃煮沸15min，再12000r/min离心5min，收集上清。上清即可以作为模板进行PCR扩增。（3）PCR：在1个PCR管中依次加入10×Buffer：2.5µL2mmol/LdNTP：5µLepf-1、epf-2：各0.2µLcps2J-1、cps2J-2：各0.3µLmrp-1、mrp-2：各0.3µLTaq酶0.3µL模板1µL补双蒸水至25µL94℃预变性2min，94℃50s，53℃40s，72℃50s，运行30个循环，最后延伸8min。取5µLPCR产物，于1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察。cps2J-230bpepf-570bpMrp-860bp琼脂糖凝胶电泳结果马链球菌兽疫亚种（旧称兽疫链球菌）：可致多种家畜的炎症及败血病，包括马的创伤感染、败血症、子宫炎、流产、幼驹脐带炎；牛乳腺炎、子宫炎；猪败血症、关节炎；羊败血症、心包炎、胸膜炎、肺炎；鸡败血症等。

马链球菌马亚种（旧称马腺疫链球菌）：是引起马腺疫的病原体。感染马下颌淋巴结形成脓灶。

肺炎链球菌(又名肺炎球菌、肺炎双球菌)：常引起人大叶性肺炎或脑膜炎，亦可致幼畜肺炎或败血症。第三节肠球菌属

肠球菌属原先属于链球菌属的D群成员。鉴于二者16SrRNA序列的差异，1984年Schleifer提议将其独立建属，并于1994年获得确认。现归属于球菌纲，乳酸杆菌目，肠球菌科。除肠球菌属外该科还包括奇异杆菌属、蜜蜂球菌属、四联球菌属及漫游球菌属。形态及培养特性肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰阳性球菌，老龄菌可呈革兰阴性。无鞭毛、无芽孢，为需氧或兼性厌氧菌。对营养要求高，在血平板37℃培养18h，可形成灰白色、不透明、表面光滑、直径0.5-1mm大小的圆型菌落，不同的菌株产生不同的溶血现象。致病性及致病机理家畜最常见的是本属菌所致的尿道感染，鸡则为心内膜炎。致病机理不明，推测可能与抗生素的滥用导致菌群失调有关，肠球菌因对抗生素有较大抗性而成为机会致病菌。第四节蜜蜂球菌属