噬菌体展示技术及

噬菌体展示技术及第一页，共十九页，编辑于2023年，星期二噬菌体 噬菌体是感染细菌、支原体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌等的一类病毒，亦称细菌病毒。噬菌体的结构简单，基因数较少，已成为分子生物学研究的重要工具；另外，因其还可作基因的载体，故又被广泛应用于遗传工程的研究。第二页，共十九页，编辑于2023年，星期二噬菌体

？噬菌体展示技术第三页，共十九页，编辑于2023年，星期二Ph.D.由来1985年，Smith首次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了该技术。1988年Parmley发现已知抗原决定簇与PⅢ的N端融合在噬菌体表面后，可特异性地被抗体选中，因此提出了通过构建随机肽库了解抗体识别的抗原表位的设想。1990年Scott将噬菌体随机多肽库成功应用于筛选抗原表位，之后国内外学者进行了大量的相关研究，有力地推动了病毒抗原表位的研究进程。第四页，共十九页，编辑于2023年，星期二Ph.D.概念噬菌体展示：将外源肽或蛋白与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面，进而通过筛选表达有目的肽或蛋白质的噬菌体，得到大量富集，然后通过DNA序列测定进行定性。第五页，共十九页，编辑于2023年，星期二融合蛋白M13噬菌体展示外源基因模式图第六页，共十九页，编辑于2023年，星期二因此，噬菌体展示技术堪称表型与基因型的统一。外源蛋白或多肽的表型和基因型被统一在了同一噬菌体颗粒内，通过表型筛选就可以获得其编码基因。第七页，共十九页，编辑于2023年，星期二Ph.D.系统类型根据所用噬菌体类型的不同，又可以分为丝状噬菌体(M13，fd,f1)展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统、噬菌粒展示系统等。第八页，共十九页，编辑于2023年，星期二λ噬菌体展示系统第九页，共十九页，编辑于2023年，星期二T4噬菌体展示系统1.T4噬菌体病毒颗粒是在宿主细胞内组装，被组装的融合蛋白无需通过质膜，不需要通过分泌途径，因而其表面展示多肽和蛋白的范围广。同时噬菌体还能在体外组装，这对构建表面展示噬菌体十分方便。2.T4噬菌体展示周期在基于T4生命的非必需衣壳蛋白SOC和HOC。第十页，共十九页，编辑于2023年，星期二M13噬菌体展示系统Ph.D.-12TM噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白（pⅢ）上，因此是一个组合文库。融合蛋白模式图第十一页，共十九页，编辑于2023年，星期二K=GorT;M=AorC

随机十二肽-gⅢ融合蛋白的N末端序列第十二页，共十九页，编辑于2023年，星期二文库的随机序列区域仅用32个密码子编码所有20种氨基酸。这使单密码子氨基酸的出现频率相对较高，同时排除了三个终止密码子中的两个。在构建该文库的菌株中，琥珀终止子TAG(*)可被Gln抑制。精简密码子表第十三页，共十九页，编辑于2023年，星期二Ph.D.生物淘洗程序示意图洗去未结合的噬菌体洗得特异性结合的噬菌体包被靶分子并加入肽库，肽库特异性吸附靶分子于ER2738扩增后进行下一轮淘洗第十四页，共十九页，编辑于2023年，星期二用Ph.D.-12肽库测定抗原决定簇。用抗®-内啡肽单克隆抗体对Ph.D.-12展示肽文库进行液相淘选的结果。每轮淘选所选到的结合序列与®-内啡肽的前12个氨基酸残基序列比较列于上图内，共有序列元件用方框示出。第十五页，共十九页，编辑于2023年，星期二Ph.D.筛选抗原表位的优点在抗原表位的研究中，使用噬菌体肽库作为筛选工具的优点：

1.可以呈现出“靶分子—模拟位”反应的自然态。小型外源肽的定向插入对噬菌体正常的生活周期影响甚微，这有利于表位潜力基因的顺利表达和保持天然的构象。

2.高通量筛选。噬菌体肽库的库容一般可达109～1012，足以将靶分子的配体从中挑选出来。

3.易于纯化。由于M13噬菌体是非裂解噬菌体，成熟的噬菌体分泌到培养上清中，可通过沉淀剂将绝大部分噬菌体粒子沉淀下来，从而获得富集的阳性噬菌体克隆。第十六页，共十九页，编辑于2023年，星期二Ph.D.技术的局限性作为一种应用工具，噬菌体展示技术也有自己的局限性，主要表现在：

1.该技术始终需要借助于其它的分析系统，如表位预测、蛋白分析、原核表达等辅助性系统以及其他各种设计合理的实验性平台，共同完成抗原表位的精确定位。

2.在该系统中细胞毒性分子和真核生物蛋白难以表达和展示；构象型表位由于不具备线性表位的“一体性”结构，所以研究难度相对增大，即使采用富含loops的肽库遴选表位模拟物，与天然的蛋白构象之间仍然会存在些许偏差。第十七页，共十九页，编辑于2023年，星期二Ph.D.的应用前景近几年来，噬菌体展示技术在应用研究方面显示出极大的实用性，一些极具应用前景的产品如TPO、抗病毒多肽疫苗、肿瘤相关抗原p53等正处于国际知名公司和研究机构的研究开发之中。可以预测噬菌