骨髓细胞形态学检查操作流程

骨髓细胞检验一、骨髓的取材骨髓取材方式主要有两种，即骨髓穿刺术及环钻术，后者又称骨髓活检。特别适合用于“干抽”情况下且可看到造血组织的天然结构，能判断造血组织与脂肪组织的比例，有助于对再生障碍时病情严重程度的估计，也有助于骨髓纤维化、骨髓转移癌及MDS的诊断。骨髓穿刺部位胸骨穿刺在第二与第三肋骨之间的胸骨正中线上穿刺，穿刺针长度固定在1cm以下。脊突穿刺第三、四腰椎脊突为穿刺点，在此处进行穿刺。髂前上棘穿刺髂骨前上棘后约3cm处。髂后上棘穿刺此处骨质较薄，容易穿刺，骨髓液较丰富，若作骨髓培养，须取5ml~10ml骨髓液。骨髓穿刺时应注意的问题骨髓穿刺一般由临床医生自行操作，检验人员也应了解以下有关问题：穿刺前必须向患者作耐心的解释，以尽量减少患者的恐惧心理。穿刺术必须严格无菌操作，盛骨髓的玻片不能接触穿刺针头。骨髓抽取量不宜过多，一般以少于0.2ml为最好。抽量过多可导致外周血液稀释，失去诊断意义。穿刺困难时，只要针芯有一小滴骨髓即可涂片，若需要作细菌培养或其他检查，也应先抽少量涂片，然后再抽所需量。干抽的意义干抽是指多部位多次穿刺均抽不出骨髓。可见于骨髓造血细胞异常增生，如白血病、真性红细胞增多症等，更易见骨髓纤维化症。肯定干抽时可用环钻术取活检标本，同时将环钻针内沾有的骨髓液涂片。骨髓液稀释此情况由于吸取骨髓液用力过大或穿刺针头刺入骨髓血窦所致，可见涂片上骨髓小粒及脂肪滴减少，各阶段细胞比例失调，中性粒细胞分叶核﹥杆状核，无巨核细胞、组织嗜碱细胞、网状细胞等。穿刺部位的差异骨髓造血组织分布不均，且某些病变也可限于局部，因此穿刺部位的不同，其结果可有显著差异。如再生障碍性贫血，特别是慢性再障，往往远心部位的髂骨最易首先受损，棘突次之，而胸骨则可再生良好。即或是同一部位的髂骨也有灶性增生现象，可致两次穿刺结果不相同。某些疾病诊断阳性率也因穿刺部位而异。多发性骨髓瘤、转移癌时，均以病变部位穿刺阳性率最高。因此对一些疑难病例最好是多部位穿刺。死亡病例若需作骨髓穿刺明确诊断时，应在死亡后半小时内进行。骨髓穿刺成功的指标在抽搐骨髓的瞬间，病人有特殊的疼痛感。在黄白色的骨髓小粒，多集中于片尾部。镜下有骨髓内特有的细胞，如巨核细胞、幼红细胞、浆细胞及网状细胞等。粒细胞的杆状核与分叶核的比值大于外周血，网织红细胞、有核细胞值均应高于外周血。二、骨髓涂片骨髓涂片的制备是一项重要的工作，绝对不可忽视。有时骨髓取材良好，但由于玻片的不清洁或推片技术不佳，而不能得到满意的涂片。如涂片太厚细胞重叠则无法辨认细胞的结构；涂片太薄，细胞过于分散，则影响检查速度和准确性，甚至漏诊或误诊。因此必须制备薄厚适宜、分布均匀的涂片。涂片制备取髓液一滴置于载玻片的一端，以边缘平齐的推片（最好比载片稍窄或磨去两角）的一端放在骨髓液的前方，逐渐后移接触骨髓液，使骨髓沿推片散开，将推片与载片保持约30°角，平稳地向前推进至玻片的另一端，载片上便留下一薄层骨髓液膜。图片制成后，在空气中挥动，使其迅速干燥，以免细胞皱缩。涂片的要求及注意事项玻片要干净，不能用手指触摸玻片表面。一张良好的骨髓涂片，要求厚薄适宜，头、体、尾明显，细胞分布均匀。骨髓内纤维蛋白原含量高，易凝固，穿刺后应立即涂片。应选择有骨髓粒部分涂片。图片干燥后用铅笔在髓膜头部写上姓名、编号、日期。骨髓液一般不用抗凝剂，必要时可用肝素抗凝，但用量不宜过多，否则影响细胞形态。三、骨髓涂片的染色骨髓中有核细胞量多，又有许多幼稚细胞，因此染色时应注意以下问题：涂片要新鲜，涂片后立即进行染色，如不能立即染色，应先固定后保存，但也不宜保存过久，否则血浆蛋白质分解，使染色背景变蓝，效果不佳。固定时间比血片稍长或另用无染料的甲醇或乙醇固定5min~10min。染液的用量应多于染血片，但不宜过浓，染色时间要长些，使幼稚细胞受色均匀，结构清楚。最好用瑞特和吉氏混合染液染色。细胞染色时间长短除与气温有关外，也与细胞增生情况，各批染液的性能有关，故要将染色中的涂片，在显微镜下观察，待颗粒清楚，胞核与胞质分明，着色满意后再终止染色，然后再冲洗、待干、镜检。染色过深的涂片，可用瑞特染液滴加于涂片上马上冲洗。过浅可复染，此时先加缓冲液后加染液，混合后复染到需要的深度为止。四、骨髓细胞分类和骨髓现象观察（一）骨髓片的低倍镜观察1.观察涂片情况了解骨髓涂片厚薄是否适度，有核细胞是否较丰富，细胞分布是否均匀，细胞受色是否满意，若涂片情况较差，应另选良好涂片，并将情况填写记录。2.判断骨髓增生程度除个别情况通过骨髓有核细胞直接计数判断增生程度外，一般均借助骨髓涂片中有核细胞与成熟红细胞的比例进行判断，据此可将增生程度分为5级（见表20-6）。由于穿刺吸取骨髓时，只有西式的可能而无浓缩的机会，因此检查结果介于两级增生程度之间时，可将其增生程度上提一级。例如在增生活跃与增生明显活跃之间，应判断为增生明显活跃。对增生减低的标本，应观察全部送检的骨髓片，以免遗漏有代表性标本，而误将外周血稀释的不分涂片认为增生减低。表20-6涂片、不同染色的情况下，细胞受色的深浅、染色质着色的程度等，均不尽相同，因此判定细胞时，应结合同一涂片中各种正常细胞染色的实际情况进行分析。2．各细胞系的原始细胞虽有特征，但极相似，甚难鉴别，除应作相应的化学染色协助区别外，也可根据出现的幼稚细胞或成熟细胞，推测原始细胞的所属。3．由于细胞发育是一个连续的过程，具有两个发育阶段之间特征的细胞属于正常的过渡形式，此时一般按成熟方向拟归于下一阶段来计数。病理情况下细胞发育紊乱，胞核与胞质发育失去平衡，对失衡较轻者也按上述情况处理。发育失调相差太远，如形态基本是原始阶段的细胞，但胞质中却出现几个特异性颗粒，此时一般以胞核形态和多数特征为划分阶段的依据，但在骨髓象描述中应加以说明。4．实属难以确定的细胞，可列入分类不明细胞栏中，但不应过多，若有一定数量，则应通过细胞化学染色或请专家会诊等方法弄清楚细胞类别。实在困难时应作形态学描述或加以照相记录，或用有关针对细胞表面标志的单抗进行区别。5．急性白血病时对退化破碎的细胞，应单独计数，了解其出现的百分率和形态，用以估计原始细胞的类型。如网状细胞样裸核多时，支持急性单核细胞性白血病时退化细胞的百分率较高，单核细胞白血病则较低。但上述情况并不是绝对的，只能供分析细胞类型时参考。6．作骨髓象检查的同时，应作血象观察，二者互为对照，有利于诊断和鉴别诊断，二者的关系有以下四种情况：（1）骨髓相似，血象显著不同：如急性失血性贫、某些溶血性贫血、缺铁性贫血的骨髓象均属增生性贫血，有时不易区别，但于急性失血性贫血时其血象常见血小板、中性粒细胞增多，且可见核象左移；而缺铁性贫血时白细胞、血小板多正常或减少，成熟红细胞常有中心染色过浅现象；而溶血性贫血除网织红细胞明显增多外，75%患者外周血可见幼红细胞。恶性肿瘤所致类白血病反应的骨髓象所见能区别开来，而慢性粒细胞白血病时血片与骨髓片区别不显著。神经母细胞瘤骨髓内转移时其弥散的肿瘤细胞与急性粒细胞性白血病的原粒细胞很难区别，但前者血片中成熟粒细胞增多，仅可出现少数不成熟粒细胞（晚幼及中幼粒细胞），而后者则出现大量原粒细胞及早幼粒细胞。（2）血象相似，骨髓象有显著不同：如传染性单核细胞增多症和慢性淋巴细胞白血病的血片皆可显示小淋巴细胞明显增多，但前者的骨髓涂片中，淋巴细胞稍增多，而后者却显著增多，常达60%以上。又如某些非白血性急性白血病，再生障碍性贫血以及黑热病的血涂片皆显示全血细胞显著减少，但这三种病的骨髓象却有显著区别：急性白血病时，原始及幼稚细胞显著增多；再生障碍性贫血时则粒、红系减少，淋巴细胞相对增多；黑热病时虽可见红系增生，但却能发现利杜小体。（3）骨髓象变化不显著而血象有显著异常，或骨髓象有显著改变而血象变化不明显：前者如传染性单核细胞增多症，后者如多发性骨髓瘤、高雪氏病、尼曼-皮克氏病等。（4）血象是骨髓象的继续：白血病的血象变化随骨髓而异，但有程度上的差异，血片的细胞成熟程度比骨髓为好，细胞愈成熟愈易辨别，故从骨髓片不易决定类型时，参考血片可协助判断细胞类型。五、骨髓细胞学检验的临床应用1．诊断造血系统疾病骨髓是机体重要造血器官，各种血液病常导致血细胞发生质与量的改变，对于白血病特别是非白血性白血病、再生障碍性贫血、巨幼细胞性贫血、多发性骨髓瘤及特发性血小板性紫癜等的诊断有决定性意义。血液病治疗过程中，也常通过骨髓检查来评价疗效或判断预后。2．帮助诊断某些代谢障碍性疾病如高雪（Gaucher）氏病、尼曼-皮克（Niemann-pick）氏病是由于脂类代谢酶的遗传性缺陷，导致脂类在单核-巨噬细胞系统细胞内沉积的疾病，在骨髓涂片中找到其特殊细胞即可确定诊断。3．