LH20装填和使用说明

经典word整理文档，仅参考，转Word此处可删除页眉页脚。本资料属于网络整理，如有侵权，请联系删除，谢谢！SephadexLH-20装填指南葡聚糖凝胶SephadexLH-20使用说明同SephadexLH20使用心得谈：123第2洗45）））5Sephadex－20分离黄酮类化合物经验）。生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最有效的纯化流程。1.测定分子量、PI当目标蛋白的物理特性如分子量、PIPAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的SuperoseHR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH。2.选择层析方法若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：一]使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如SuperoseSephacrylHR依据分子量将样品分成不同组份。二]物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。三]体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。3.纯化大量粗品sepharosebigsepharoseXLsepharosefastflow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。4.纯化硫酸氨样品硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，需先用SephadexG-25脱盐。疏水层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用HitrapHICTestKit和RESOURCEHICTestKit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。5.纯水糖类分子固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残基，很适Sepharose6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。6.纯化膜蛋白在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。7.纯化单抗、抗原*单抗多为。来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。MabselectProteinG和ProteinA对IgG的FcIgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白GA介质Mabselect和rProteinASepharoseFF对IgGrProteinA用离子交换QSepharoseHP或凝胶过滤Superdex200，很容易去除。*疏水层析PhenylSepharoseHP亦很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex200在精细纯化中去除。*纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHsactivatedSepharoseFF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。*HiTrapIgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗5mgHiTrapIgY是专门用来纯化，结合量达100mg纯。8.纯化重组蛋白重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。Amershambiosciences统。一]GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用GlutathioneSepharose4B作亲和层析纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。2．蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgGSepharose6FF纯化。二]Histidine-tagged）的融合蛋白可用ChelatingSepharoseFF螯合Ni2+金属，在8MHisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。9.纯化包涵体蛋白包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8MSuperose12及Sepharose6FFSuperdex75、QSepharoseFF和PhenylSepharoseFF分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品SOURCE30RPC1MnaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收率明显提高。10.包涵体蛋白固相复性近年许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附）在层析介质上，一般用各种SepharoseFF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在介质上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成，所以复性得率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。固相复性方法也被用于以HiTrapChelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白；以HiTrapHeparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用，比一般试剂盒更方便、耐用。11.纯化中草药有效成分中药的化学成分极其复杂。传统中药多是煎熬后服用，有效成份多较为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合性地利用多种层析方法。如离子交换、分子筛、反相层析，更容易分离到单一活性成分。SephadexLH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛功能，例：如用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，最后是甙元。SephadexLH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，HiTrapSP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常HiTrapQ阴离子交换柱上分离效果良好。一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex，Sephacryl。若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可选择新一代的Superdex。一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组份纯品。另外，多糖药物需去除可引起过敏的蛋白质，传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需反复数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。SOURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂，SOURCE反相层析可用范围为PH1-14，并可用1M1MHCL清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命也更长。12.纯化肽类肽类的来源有天然萃取，合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解，但可从有机溶剂或促溶剂中复性，所以多以高选择性的反相层析如SOURCESOURCESOURCE5RPC或离子交换Minibeads、Monobeads作纯化。SuperdexPeptideHR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱，能配合反相层析做出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex30PG。13.纯化核酸、病毒核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCRDNASephacryS-1000SF、Superose或Sepharoce4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离子交换如MonoQ、SOURCEQ分离核酸。14.纯化寡核苷酸寡酸苷酸多应用在反义(anti-sense)DNARNA测序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以阴离子交换的MonoQ或快速低反压的SOURCEQ在PH12下可除副产物，并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析，可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。15.脱盐、小分子去除使用凝胶过滤介质Sephadex，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。SephadexG25系列介质专为蛋白质脱盐而设计，预装柱HiTrap（5mlHiPrepDesalting(26ml)可在数分钟为多至10ml样品脱盐。16.疫苗纯化使用凝胶过滤介质Sepharose4FF10%。柱高一般40-70cm，整个过程约半至一小时。目前使用此法生产的疫苗品种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。分子量较小的疫苗可使用SephacrylS-500HR，如甲肝疫苗等。17.抗生素聚合物分析中国药典从2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的白分比，规定使用SephadexG10凝胶过滤法测定。18.纯化-基因治疗用病毒载体SORRCE15Q19.纯化-基因治疗用质粒QSepharose，SOURCE，STREAMLINEQ，SephacrylS500，Plasmidselect在下游纯化中,可应用不同层析技术在纯化生物分子的同时,去除各种污染物。1.去除——内毒素内毒素又称热原。含脂肪A、糖类和蛋白，是带负电的复合大分子。内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性。但在高盐下会凝集，无法上疏水层析。利用疏水层析试验盒（17-1349-01）可选择结合目标蛋白的介质而去除内毒素。内毒素与阴离子交换介质Q或DEAESepharoseFastFlow有较强结合。可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。利用CNBr或NHSSepharoseFF可偶联内毒素底物如，，自动成亲合层析介质结合内毒素。内毒素经常是多聚体，凝胶过滤层析可有效地将之去除。2.去除——蛋白中的核酸大量核酸增加样本黏度，令区带扩张，反压增加，降低分辨率和流速。药审和食检对核酸含量也有严格限制。胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。核酸带阴电荷，在初步纯化时利用阳离子交换介质如STREAMLINESP，SPSepharoseBigBeads,SP或CMSepharoseFF,SPSepharoseXL结合目标蛋白，可除去大量核酸。核酸在高盐下会和蛋白解离,疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白,在纯化蛋白的同时去除核酸。利用核酸酶将核酸切成小片断,用凝胶过滤做精细纯化时便很容易去除了。3.去除——病毒和微生物病毒和微生物可成为病原应尽量减除。结合不同层析技术，使用注射用水，用NaOH定期进行仪器和凝胶的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。病毒大都有脂外壳。可用与目标蛋白电荷相反的S/D（solvent/detergent)处理，使病毒失活，如Triton和。再用适当的离子交换介质如CMSepharoseFF结合目标蛋白，去除。其它污染物可以改变pHSuperdex及多种吸附性介质，SOURCE都是很好的精细纯化介质,可去除多种微量污染物。绍凝胶层析的理论（分子筛理论），重点介绍Sephadex葡聚糖凝胶层析方法和试验。gelfiltration）技术是60年代兴起的一种简便有效的生物分离纯化方法。当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，因凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻于外部，在或者称为凝胶层析。凝胶是不溶于水，在水中却有较大膨胀度和较好的分子筛功能的一类化合物。目前主要有葡聚糖凝SephadexSapharoseBio-Gel其后还发展了凝胶的各种衍生物，如羧甲基-交联葡聚糖（CM-Sephadex），二乙基氨乙基-交联葡聚糖（DEAE-Sephadex）等种类。由于凝胶过滤技术设备简单、操作方便，重复性能好和样品得率高等特点。广泛应用于生命科学领域，如蛋白质、核酸、多糖氨基酸、激素和抗生素等物质的分离纯化。凝胶层析在载脂蛋白的分离纯化中，属于使用最多的技术手段。凝胶过滤装置种类很多，其基本操作过程大同小异，操作步骤主要有：①凝胶种类的选择，按被分离物的性质及分子量大小而定；②凝胶柱的制备；③加样与洗脱；④分部收集透析，浓缩。一、基本理论（一）分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小排队，凝胶表现分子筛效应。（二）色谱柱的重要参数⑴柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt表示。⑵外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。不包括固体支持物的体积（Vg）。Ve少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。二、凝胶的种类及性质⑴SephadexG交联葡聚糖的商品名为SephndexG表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。⑵Sephadex─Sephadex-25的羧丙基衍生物，商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。（三）聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P（Bio-Gel），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10P后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。三、实验技术（一）层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:1─10:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。（二）凝胶的选择根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如SephadexG-20的吸水量为201克SephadexG─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的SephadexG-200效果好，脱盐用Sephadex、G-50，用粗粒，短柱，流速快。（三）凝胶的制备商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。SephadexG-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30％。分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。（五）防止微生物的污染交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有:⑴叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20℃时约为％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。⑵可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。⑶乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0.01％。在微酸性溶液中最为⑷苯基汞代盐在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01％。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。选择层析方法SuperoseSephacrylHR根据分子量将样品分成不同组份。二、用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。也可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一部即可得到高纯度样品。三、大体积的样品、常使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。脱盐、小分子去除使用凝胶过滤介质SephadexG10、G15、G25、G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。SephadexG25HiTrapDesalting(5ml)可用针筒操作。HiTrapDesalting(26ml)可在数分钟为多至10ml样品脱盐。:zhouchao2006发布日期:2008-03-15如何选择凝胶做分离纯化工作的人都知道，选择合适的填料是至关重要的。1.测定分子量、PI当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGESuperoseHR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH。2.选择层析方法若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：一]使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、SephacrylHR依据分子量将样品分成不同组份。二]得到高纯度样品。三]直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。3.纯化大量粗品处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用sepharosebigbeads、sepharoseXL、sepharosefastflow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。4.纯化硫酸氨样品SephadexG-25脱盐。疏水层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用HitrapHICTestKit和RESOURCEHICTestKit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。5.纯水糖类分子固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可Sepharose6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。6.纯化膜蛋白此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。7.纯化单抗、抗原*单抗多为IgG。来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、ProteinG和ProteinA对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步纯化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG。重组蛋白A介质Mabselect和rProteinASepharoseFF对IgG有更高的载量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProteinA用离子交换QSepharoseHP或凝胶过滤Superdex200，很容易去除。*疏水层析PhenylSepharoseHP亦很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex200在精细纯化中去除。*纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHsactivatedSepharoseFF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。*HiTrapIgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mgIgM。HiTrapIgY是专门用来纯化IgY，结合量达100mg纯IgY。8.纯化重组蛋白细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。Amershambiosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。一]GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用GlutathioneSepharose4B作亲和层析纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。2．蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgGSepharose6FF纯化。二]含组氨酸标记（Histidine-tagged）的融合蛋白可用ChelatingSepharoseFF螯合Ni2+金属，在一般或变性条件（8M尿素）下透过组氨酸螯合融合蛋白。HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。9.纯化包涵体蛋白包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。高化学稳定性的Superose12及Sepharose6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象。Superdex75、QSepharoseFF和PhenylSepharoseFF分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好。SOURCE30RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以1MnaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收率明显提高。10.包涵体蛋白固相复性*近年许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附）在层析介质上，一般用各种SepharoseFF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。*固相复性方法也被用于以HiTrapChelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白；以HiTrapHeparin肝素亲和层析直均可反复多次重复使用，比一般试剂盒更方便、耐用。11.纯化中草药有效成分效成份多较为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合性地利用多种层析方法。如离子交换、分子筛、反相层析，更容易分离到单一活性成分。SephadexLH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛功能，例：如用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，最后是甙元。SephadexLH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。*生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，HiTrapSP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。相反，黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中，在HiTrapQ阴离子交换柱上分离效果良好。*一般多糖纯化大多使用分子筛如在600KD以下，并需更高分辨率，可选择新一代的Superdex。一般植物可能含Sevag方法用蛋白质。SOURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分反相层析可用范围为PH1-14，并可用1MNaOH，1MHCL清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命也更长。12.纯化肽类肽类的来源有天然萃取，合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解，但可从有机溶剂或促溶剂中复性，所以多以高选择性的反相层析如SOURCE30RPC、SOURCE15RPC、SOURCE5RPC或离子交换Minibeads、Monobeads作纯化。SuperdexPeptideHR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱，能配合反相层析做出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex30PG。13.纯化核酸、病毒核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子，和质粒DNASephacryS-1000或Sepharoce4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离子交换如MonoQ、SOURCEQ分离核酸。14.纯化寡核苷酸和cDNAMonoQ或快速低反压的SOURCEQ在PH12下可除副产物，并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析，可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。15.脱盐、小分子去除使用凝胶过滤介质Sephadex等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积去除小分子，柱高