血红蛋白的提取和分离

-1-知识梳理能力突破专题5

5.3血红蛋白的提取和分离重点掌握：（1）提取蛋白质的基本过程与方法；（2）理解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理；（3）实验：初步分离血红蛋白的方法问题串1、分离蛋白质的基本思路是什么？2、什么是凝胶色谱法？其原理是什么？2、缓冲溶液的作用是什么？如何配置缓冲液？3、电泳是指？其原理是什么？4、蛋白质的提取和分离一般分为几个步骤？血红蛋白的基本组成？5、洗涤红细胞的目的是？6、凝胶色谱操作包括？课题3血红蛋白的提取和分离一、基础知识:【思考1】:1、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？2、本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的差异进行提纯？3、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质？

血红蛋白只存在于红细胞内，含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团血红蛋白的特点：一、基础知识--蛋白质提取和分离原理

蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质：

形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。提取分离方法凝胶色谱法

电泳法

1、原理：2、材料-小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。凝胶(一)凝胶色谱法（分配色谱法）：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法3、具体过程（课本65图5-13）一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理分子量大小直径大小运动方式运动速度运动路径洗脱次序一、基础知识---蛋白质分离的原理大于凝胶颗粒孔隙直径，被阻挡在颗粒的外面小于凝胶颗粒孔隙直径，可以进入颗粒内部垂直向下移动垂直向下移动，无规则扩散进入颗粒内部较快较慢较短较长先从凝胶柱洗脱出来后从凝胶柱洗脱出来1、什么是缓冲液？2、缓冲液的作用是什么？【思考2】:（二）、缓冲溶液

在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等

能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。

2.原理：(三)电泳1.电泳的概念指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

凝胶电泳原理示意图

在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率完全取决于分子大小。(三)电泳3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。4.聚丙稀酰胺凝胶电泳分离过程：高考考向1

以文字信息为载体考查1．凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。

A分子的大小B相对分子质量的大小

C带电荷的多少D溶解度2．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。

A相同B相反C相对D相向BB二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。↓↓↓（一）样品处理血液血浆水分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团血液的成分（一）样品处理及粗分离1、红细胞的洗涤：

（2）目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色（1）步骤：柜式离心机初次离心后的结果3次洗涤后的结果在蒸馏水和甲苯作用下搅拌，红细胞破裂释放2、血红蛋白的释放：蒸馏水的作用是加入甲苯的作用是充分搅拌的目的是使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂搅拌器转子磁力搅拌器搅拌器正在工作易错警示1总复习优化方案P273不清楚血红蛋白释放时蒸馏水和甲苯的作用3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液中速离心10min离心管滤纸过滤脂类物质烧杯红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000r/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明液体。分离血红蛋白溶液有机溶剂无色透明的甲苯层脂类物质白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液红色透明液体红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物典例1.为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）。

A.NaClB.甲苯C.蒸馏水

D.柠檬酸钠D2.将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（）A.无色透明的甲苯层B.脂溶性物质的沉淀层C.血红蛋白的水溶液D.其他杂质的暗红色沉淀物C20mmol/L磷酸缓冲液1mL1mL4、透析（粗提取）：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。利用透析袋透析（二）纯化－－凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：3.样品的加入和洗脱收集得到的纯化后的蛋白质易错警示2总复习优化方案P273不清楚血红蛋白提取与分离中历次“除杂质”或“分离”的原理红细胞内含有大量血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题：(1)血红蛋白的提取和分离一般可分为四步：________、粗分离、纯化和________。(2)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行处理、离心后，收集血红蛋白溶液。以上所述的过程即是样品处理，它包括红细胞的洗涤、____________________、____________________。(3)收集的血红蛋白溶液要进行粗分离，其方法是________。然后通过________将样品进一步纯化，最后经________进行纯度鉴定。高考考向1

以文字信息为载体考查样品处理纯度鉴定血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液透析凝胶色谱法SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳下图是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品加入和洗脱示意图。请据图回答下列问题。①在加样品示意图中，正确的顺序是___________________。②用吸管加样品时，应注意正确操作，______________；③待______________________时，才加入缓冲溶液；④待________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每________mL收集一