总RNA纯化试剂盒说明

此款RNA纯化试剂盒提供了一种从培养的动物细胞、组织样品、血液、细菌、酵母、真菌、植物和病毒中快速提取和纯化总RNA的方法，该试剂盒可以纯化所有大小的RNA,从大的mRNA和核糖体RNA到小RNA（microRNA或miRNA）和小干涉RNA（siRNA）。RNA优先从蛋白等的细胞组分中纯化出来，而不使用抑制的苯酚或者氯仿。纯化的RNA是高度完整的，可以应用到一系列的下游应用试验中，包括实时PCR，Northern免疫印迹分析，RNase保护实验和引物延伸,以及表达芯片分析。纯化技术纯化的基础是旋转柱色谱法，用特有的树脂作为分离介质。RNA优先从其他细胞组分（如蛋白质）中分离出来，而不使用苯酚或者氯仿。纯化步骤包括首先用合适的裂解液融解细胞或组织，然后裂解液中加入乙醇后上样到旋转柱中。树脂结合RNA是基于离子的浓度，所以只有RNA结合到柱子上而所有剩余的蛋白和其他的污染物会在流动液中而被除去或者仍在树脂的顶部。然后结合的RNA用试剂盒提供的洗涤液洗涤以除去所有残余的杂质，然后纯化的总RNA用抽提缓冲液洗涤。纯化的RNA是高度完整的，可以用于一系列的下游实验分析。说明试剂盒说明书柱子结合容量50yg柱子取大上样体积600yL纯化RNA大小所有大小，包括小RNA（v200nt）起始材料最大量动物细胞3x106个细胞动物组织10mg（对于大部分组织*）血液100yL细菌1x109个细胞酵母1x108个细胞真菌50mg植物组织50mg完成10次纯化时间20min平均收率HeLa细胞（1x106个细胞）15ygE.coli（1x109个细胞）50yg优点使用旋转柱提取，步骤快且简单・提取总RNA,从大的核糖体RNA（rRNA）至1」小（RNAmicroRNA或者miRNA）不需要苯酚或氯仿作提取液・从多种种类来源样品中提取高质量的总RNA•可以提取和检测到的RNA组织样品可以小到单个动物细胞试剂盒成分成分50preps裂解液40mL洗涤溶液22mL抽提缓冲液6mL微型旋转柱50收集管50抽提管(1.7mL)50产品说明书1储存条件和产品稳定性所有的溶液需在室温密闭保存。所有的试剂在不开封条件下稳定保存1年。预防措施和警告事项该试剂盒只为科研目的设计，不可用于人或者临床。要确保有合适的实验服，在操作化学试剂时一次性的手套和护目镜会磨损。需要更多信息，请参考适合的材料安全表（MSDSs）。所有人和动物组织的问题是要考虑到潜在的感染。当操作全血样品时，所有在使用国家的有关当局建议的预防措施都要执行。用户自备试剂和设备你需要有以下所需材料才可以使用总RNA纯化试剂盒对于所有材料的实验步骤•台式离心机•95-100%乙醇・作巯基乙醇对于动物细胞实验步骤PBS（无RNase）对于动物组织的实验步骤液氮研钵和研杵・70%乙醇对于鼻喉抹片样品的实验步骤・无菌，一次性抹片对于细菌的实验步骤・含溶菌酶的TE缓冲液J对于革兰氏阳性细菌，在TE缓冲液中1mg/mL溶菌酶对于革兰氏阴性细菌，在TE缓冲液中3mg/mL溶菌酶对于酵母的实验步骤含有溶细胞酶的重悬浮缓冲液50mMTrispH7.510mMEDTA1M山梨糖醇1单位/儿溶细胞酶对于真菌的实验步骤液氮研钵和研杵70%乙醇对于植物的实验步骤液氮研钵和研杵70%乙醇RNA的操作RNase是降解RNA的稳定性和活性很强的酶。高压灭菌的溶液和玻璃器皿总是不能有效除去这些酶。所以当操作RNA准备工作的第一步就是有一个无RNase的环境。下面这些预防措施是推荐的针对这些酶最好的措施。・操作RNA的地方需远离微生物实验地方干净的、一次性的手套在拿放试剂、样品、移液管、一次性离心管等时会损坏。因此建议经常更换手套以避免污染・需要有RNA专用的溶液、枪尖、实验服、移液管等用具・所有的RNA操作用到的溶液都应用至少0.05%DEPC处理的高压灭菌水或者用分子生物学指定的无RNase水配制・用商用的除RNase的溶液清理表面・当使用提纯的RNA样品时，在用于下游实验过程中确保其在冰上放置流程图用总RNA纯化试剂盒纯化RNA的实验步骤用裂解液滚解细胞或组织加入乙尊结合到注子上用洗涤液洗涤三次II涡旋或八用抽提液抽提RSA涡旋实验步骤所有的离心步骤都用台式离心机完成。不同的步骤需要不同的转速，所以请查看你的离心机的说明书以保证其能提供合适的转速。所有的理性步骤都在室温进行。准确的rpm转速可以用下面的公式计算：RPM=/RCF10^）（0这里RCF二需要用重力加速度（相当于地心引力，单位是g）；r=转子的半径，单位是cm；而RPM=达到所需地心引力时每分钟的转数部分1.不同细胞类型来源的裂解液的制备实验前须知. 根据起始材料的不同裂解液的制备步骤也不同（步骤1）.然而之后的步骤则在所有情况中都相同（步骤2-6）。请确保在从起始材料开始就要按照正确的实验步骤制备裂解液。. 所有的离心步骤都在台式离心机上，除有注释的地方，都以14,000xg（~14,000RPM）转速进行。所有的离心步骤都在室温离心。. 变速离心机可以发挥试剂盒的最大性能。如果没有变速离心机，可以用固定转速的离心机，然而这样会减少收率。. 实验前保证所有的溶液都在室温放置. 所有提供的酶在使用前都应在各自的管上内标示的温度下保存. 配制洗涤溶液使用液，在提供的装有洗涤液的瓶内加入50mL95%的乙醇（用户自备）。这样总体积为72mL。瓶子上的标签有一个方框可以用来检查是否已加入乙醇。.可选：对于大部分的动物细胞组织，尤其是那些已知含较高含量RNase的组织（如胰腺），以及大部分的植物组织和鼻喉抹片样品，强烈建议在裂解液中加入卩-巯基乙醇。而且也建议想要分离用于高灵敏度的下游实验的RNA的用户。每1mL裂解液加入10此卩-巯基乙醇（用户自备）。卩-巯基乙醇有毒性，请在通风橱中操作。否则，使用试剂盒提供的裂解液。.为提取完整的病毒RNA,如果起始材料是细胞培养物，按照部分1A,如果起始材料是组织，按照部分1B，如果起始材料是血液，按照部分1C,如果起始材料是鼻喉抹片样品，按照1D。对于从无毒的病毒颗粒中提取RNA,按照部分II。操作过程中动作要迅速很重要。1A. 培养的动物细胞裂解液的制备使用前须知. 建议细胞最大的起始用量是3x106个细胞。可以用血球计和显微镜对细胞计数。一般来说，普通的3.5cm培养皿可以有106个HeLa细胞。. 收集的细胞沉淀块可以再-70°C保存供以后使用，或者在实验中直接使用。在冻存前要对细胞计数。. 冻存的细胞沉淀块不能超过2星期以保证不破坏RNA的完整性。: 冻存的细胞沉淀块在实验步骤开始前不能融解。在冻存的细胞块中直接加入裂解液（步骤1A（ii）c）。1A（i）.单层培养的细胞裂解液的制备吸弃培养基，然后加入一定量的PBS冲洗细胞层。吸弃PBS。培养皿中直接加入350yL裂解液。轻拍培养皿裂解细胞，然后缓冲液在培养皿表面旋转晃动5min。将裂解液转移到离心管内。裂解液中加入200吐95-100%乙醇（用户自备）。涡旋混匀10秒。进行到步骤2。注意：对于起始细胞量大于106个细胞的样品，建议将裂解液通过装有25号针头的注射器5-10次，以使在上样到柱子前切断基因组DNA。1A（ii）.悬浮培养的和贴壁生长的细胞裂解液的制备将培养上清转移到无RNase的离心管中（未提供），然后以最大不超过200xg（〜2000RPM）的转速离心10min沉淀细胞。小心地除去上清。留下少许几微升0L）的培养基避免细胞沉淀被吸出。细胞沉淀块中加入350^L裂解液。涡旋震荡15秒裂解细胞，在进行下一步之前确保所有的沉淀块被完全溶解。d.裂解液中加入200吐95-100%乙醇（用户自备）。涡旋混匀10秒。进行到步骤2。注意：对于起始细胞量大于106个细胞的样品，建议将裂解液通过装有25号针头的注射器5-10次，以使在上样到柱子前剪断基因组DNA。1B. 动物组织裂解液的制备使用前须知.总RNA纯化试剂盒是用于从小量的组织样品中提取RNA的试剂盒（大部分实验中最大量达到10mg）。.动物组织中RNA在组织获取后，剪碎和匀浆之前是不受保护的。因此重要的是操作的步骤要尽量快，尤其是细胞裂解液制备的步骤。.新鲜组织或者冻存的组织均可。组织应迅速放入液氮中然后尽快转入70°C冰箱，长期保存。组织在-70°C中可以保持几个月。在研磨匀浆之前不能使冻存的组织融解以保证RNA的完整性。.组织应在RNA稳定液中保存，如RNAlater®可以和提取步骤兼容。在提取步骤之前用镊子将组织小心从储存液中取出，沥干多余的液体。组织类型不同，组织最大用量也不同，请参考以下的表格1以确定最大的组织用量。如•果你的组织在表格中没有包括，我们建议初始的用量不超过10mg。表1.不同组织的推荐最大起始用量组织最大起始用量脑25mg心脏5mg肾10mg肝10mg肺10mg脾脏10mg1B. 动物组织细胞裂解液的制备从动物中分离组织样品称量组织重量。请请参考以下的表格1以确定不同组织的最大量。对于表格中没有包括的组织样品我们建议初始的量不超过10mg。将组织转移至有适量液氮的研钵内，液氮应覆盖过组织。用研杵充分充分研磨组织。使研钵内液氮蒸发而不使组织融解。组织样品中加入400yL裂解液后继续研磨直至样品均匀。将裂解液通过装有25号针头的注射器5-10次使之均匀。用吸管将裂解液转移至无核酸酶的离心管内（离心管未提供）。离心2min使细胞碎片沉淀。然后上清转移至另一个无核酸酶的离心管。记录上清/裂解液的体积。收集的裂解液中等体积加入70%的乙醇（每100吐裂解液加入100吐乙醇）。漩涡混匀。继续进行步骤21C. 血液裂解液的制备实验前须知所有人和动物组织的问题是要考虑到潜在的感染。当操作全血样品时，所有在使用国家的有关当局建议的预防措施都要执行・建议血液的最大用量不能超过lOOyL，避免堵柱。・我们建议试剂盒用于从非凝集的新鲜血液中提取RNA,用EDTA作为抗凝剂。实验过程中操作要迅速。IC. 血液样品裂解液的制备将lOOyL未凝集的血液样品转移到无RNase的离心管中（未提供）。血液中加入350gL裂解液。震荡裂解细胞15秒。在进行到下一步之前保证整个混合物都变透明。裂解液中加入200gL95-100%乙醇（用户自备）。震荡混匀10秒。进行到步骤2。ID. 鼻喉抹片样品裂解液的制备使用前须知所有人和动物组织的体液都是有潜在的感染性。当操作这些样品时，所有在使用国家的有关当局建议的预防措施都要执行实验过程中操作要迅速。1D. 鼻喉抹片样品裂解液的制备将600gL裂解液加入到无RNase的离心管中（未提供）。用无菌，一次性的棉签在鼻或喉等组织内轻轻擦。用无菌的器具剪掉收集有鼻喉细胞的棉签头，放入到加有裂解液的离心管中。盖上管盖，室温轻轻震荡孵育5min0用吸管将裂解液上清转移到无RNase的离心管内（未提供）记录裂解液的体积。收集的裂解液中等体积加入70%乙醇（每lOOgL裂解液加入lOOgL乙醇）漩涡混匀。继续进行步骤21E•细菌裂解液的制备使用前须知・按照表格2配制含溶菌酶的TE缓冲液。该溶液需用无菌的，无核酸酶的TE缓冲液配制，然后在冰上放置备用。使用者自己提供这些试剂。在此步骤中建议最多用109个细菌细胞。用分光光度计测量细菌的生长情况。一般大肠杆菌OD6001.0,浓度是1x109cells/mL。・对于RNA提取，应该在对数生长期收获细菌。•细菌沉淀块可在-70°C保存以后使用，或者直接使用。•冻存的细菌菌块在开始操作之前不能融解。将含溶菌酶的TE缓冲液直接加入冻存的细菌菌块中（步骤1Ec）。1E•细菌细胞裂解液的制备14,000xg（〜14,000RPM）离心lmin收集细菌。吸弃上清，然后尽量小心移走剩余的培养基。用100此含溶菌酶的TE缓冲液漩涡震荡重悬细菌（见表1）。见表1时间室温温育。加入300吐裂解液，漩涡充分震荡至少10秒。加入200yL95-100%的乙醇（用户自备）到裂解液中。漩涡充分震荡至少10秒。继续进行步骤2表2：不同细菌类型的孵育时间细菌类型TE缓冲液中溶菌酶浓度孵育时间革兰氏阳性细菌1mg/mL5min革兰氏阴性细菌3mg/mL10min1F酵母菌裂解液的制备使用前须知. 制备一定量的含溶细菌酶的重悬液，考虑到每次需要100yL的溶液。重悬液需含有以下成分：50mMTrispH7.5，10mMEDTA，1M山梨糖醇，1%0巯基乙醇，1单位/yL溶细胞酶。溶液需要用无菌，无RNase试剂制备，然后在冰上放置直至使用。这些试剂需要用户自己提供。. 该实验建议使用的酵母菌细胞不超过107个细胞或者1mL培养液。. 对于提取RNA,需要收取对数生长期的酵母细胞。. 酵母可以可在-70°C保存以后使用，或者直接使用。. 冻存的酵母菌菌块在开始操作之前不能融解。将含溶细胞酶的重悬液直接加入冻存的细菌菌块中（步骤1Fc）。1F细胞裂解液的制备14,000xg（~14,000RPM）离心1min收集酵母菌菌块。吸弃上清，然后尽量小心移走剩余的培养基。用100卩L含溶细胞酶的重悬液完全重悬酵母细胞，漩涡震荡重悬。37°C孵育10min。加入300yL裂解液，漩涡充分震荡至少10秒。加入200yL95-100%的乙醇（用户自备）到裂解液中。漩涡充分震荡至少10秒。继续进行步骤21G真菌裂解液的制备使用前须知.新鲜或者冻存的真菌菌块均可使用。真菌样品应迅速放入液氮中然后尽快转入70°C冰箱，长期保存。真菌样品组织在-70°C中可以保持几个月。在研磨匀浆之前不能使冻存的组织融解以保证RNA的完整性。.该实验中建议真菌的用量不超过50mg，以避免堵柱。1G真菌裂解液的制备称重决定真菌的量。建议该实验步骤中真菌的用量不能超过50mg将真菌块转移到有一定量液氮的研钵中，液氮要覆盖过组织。用研杵充分研磨真菌细胞注意：该步骤研磨的真菌可以在70°C保存，以后再进行RNA提取的步骤。使研钵内液氮蒸发而不使组织融解。组织样品中加入600yL裂解液后继续研磨直至样品均匀。用吸管将裂解液转移至无核酸酶的离心管内（离心管未提供）。离心2min使细胞碎片沉淀。然后上清转移至另一个无核酸酶的离心管。记录上清/裂解液的体积。收集的裂解液中加入等体积的70%乙醇（用户自备），（每100吐裂解液中加入100吐乙醇）。震荡充分混匀。继续进行步骤21H•植物细胞裂解液的制备使用前须知.建议植物组织的样品最大量是50mg或者是5x106个植物细胞。.新鲜或者冻存的植物组织均可使用。植物样品应迅速放入液氮中然后尽快转入70°C冰箱，长期保存。植物样品在研磨匀浆之前不能使冻存的组织融解以保证RNA的完整性。.实验操作动作要迅速。1H•植物细胞裂解液的制备将小于等于50mg或者5x106的植物样品转移到有一定量液氮的研钵中，液氮要覆盖过组织。用研杵充分研磨真菌细胞。注意：如果要保存冻存的组织，在将组织转移到液氮之前不能使组织融解。使研钵内液氮蒸发而不使组织融解。植物组织样品中加入600gL裂解液后继续研磨直至样品均匀。用吸管将裂解液转移至无核酸酶的离心管内（离心管未提供）。离心2min使细胞碎片沉淀。然后上清转移至另一个无核酸酶的离心管。记录上清/裂解液的体积。收集的裂解液中加入等体积的70%乙醇（用户自备），（每100吐裂解液中加入100吐乙醇）。震荡充分混匀。继续进行步骤21I•病毒裂解液的制备使用前须知.为提取完整的病毒RNA,如果起始材料是细胞培养物，按照部分1A,如果起始材料是组织，按照部分1B，如果起始材料是血液，按照部分1C,如果起始材料是鼻喉抹片样品，按照1D。.建议使用最多不超过100gL的病毒颗粒悬液，以避免堵柱。.实验操作动作要迅速。1L•病毒裂解液的制备将lOOyL的病毒颗粒悬液转移至一个无核酸酶的离心管中（未提供）。样品中加入350yL裂解液，振荡15秒裂解细胞。在进行下一步之前保证整个混合液变为透明。裂解液中加入200yL的95-100%乙醇（用户自备），震荡充分混匀10秒。继续进行步骤2部分2・从各种裂解液的纯化总RNA注意：对于这之前不同类型的裂解液制备，从该步骤开始剩下的纯化总RNA的步骤都相同。RNA结合到柱子上用提供的收集管装柱将最多600gL裂解液和乙醇（来自步骤1）上柱，然后离心lmin注意:确定所有的裂解液通过柱子进入收集管。如果裂解液没有完全通过，再离心甩1min。弃去流动液。用另一收集管重新装柱。根据你的裂解液体积，重复步骤2b和2c。可选步骤：总RNA纯化试剂盒提取的总RNA带有少量的基因组DNA污染。然而，可以选择附A中进行柱上DNA处理步骤，以最大量地除去残余的DNA，它可能会影响下游灵敏的实验。在该实验中，这一步骤必须在此步骤进行。柱子洗涤将400gL含有DNase1的洗涤溶液上柱，离心1min。注意：确定所用的洗涤溶液通过柱子进入收集管内。如果整个洗涤液没有完全通过，再离心1min。弃去流动液，用另一收集管重新装柱。重复步骤3a和3b再次洗柱。再用400gL洗涤液第三次洗柱，然后离心1min。弃去流动液，用另一收集管重新装柱。离心甩柱2min使树脂充分变干。抛弃收集管。RNA抽提将柱子放入试剂盒提供的1.7mL抽提管中。柱子加入50gL抽提液。200xg（~2,000RPM）离心2min,然后再14,000xg（~14,000RPM）离心1min。注意从柱子中流出的抽提液，如果不足总体积50gL,柱子再次14,000xg（〜14,000RPM）离心1min。注意：为得到RNA最大收率，建议用不同的离心管做第二次抽提（重复步骤4b和4c）。RNA保存纯化的RNA样品可以在-20°C保持数日。建议样品在-70°C保存更长时间。附录A可选的柱上DNA去除DNA步骤总RNA纯化试剂盒提取的总RNA带有少量的基因组DNA污染。然而，可以选择附A中进行柱上DNA处理步骤，以最大量地除去残余的DNA，它可能会影响下游灵敏的实验。在该实验中，这一步骤必须在此步骤进行。按照操作手册的说明配制0.25K/gL无RNase的DNase1的溶液的应用液。每处理一根柱子要用掉100gL溶液。或者，用反应液溶解或稀释DNase1储液（40mMTrispH7.0,10mMMgCl2和3mMCaCl2，无RNase制备）制成最终浓度为0.25K/gL。从起始材料开始到结合到柱子（步骤1和2的所有步骤）上都要正确按照总RNA提取的步骤操作。柱子上加入400gL洗涤液然后离心2min。弃去流动液。用收集管装柱。然后100gL按照步骤1配制的无RNase的DNase1上柱，14,000xg（〜14,000RPM）离心1minute.注意：确定所有DNase1混合液过柱。如果需要，再次14,000xg（~14,000RPM）离心1min。在步骤5离心后，将收集管中流动液用移液管转移到柱子顶部。注意：一定要进行步骤5以发挥DNase最大活性和得到RNA最大收率，尤其是小RNA的收率、柱子装置在15-30°0孵育15min。不需要再进行离心，直接进入到柱子“洗涤步骤”（步骤3）疑难指导问题可能原因解决方法和解释RNA收率低细胞或组织裂解不完全确保一定量的细胞或者组织用适量的裂解液堵柱起始材料的用量不要用超过建议的用量。如果柱子在建议的水平下堵柱，应减少起始材料的量。也可以参见下面的“堵柱”问题使用了代替的抽提液建议使用试剂盒提供的抽提液以得到最大的RNA收率洗涤液中没有加入乙醇在结合到柱子上之前保证加入了一定量的乙醇细胞或组织中RNA含量低不同的组织和细胞中RNA