蛋白质的通性、纯化和表征

A．蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用

B．蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团，此外，还有少数的末端α-COOH,α-NH2

，若是缀合蛋白质，则在辅基成分中还可能包含可以解离的基团

C．蛋白质分子中可解离基团的pK‘和游离AA中相应基团的pK’值是完全不相同

D．蛋白质可看作一个多价离子带电性质和数量决定于可解离基团的种类、数量溶液的pH当前第1页\共有53页\编于星期六\11点蛋白质等电点——对某一种蛋白质来说，在某一pH值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零。这一pH称为蛋白质等电点当前第2页\共有53页\编于星期六\11点短肽的等电点和净电荷量可以根据pK值计算，蛋白质的等电点要用等电聚焦等方法测定。等电聚焦电泳：这是一种特殊的电泳，其载体上铺有连续的PH梯度的缓冲液，然后将蛋白质点样，只要该处的PH与蛋白质的PI不同，则蛋白质就会带电，PH值>PI时，蛋白质带-电；PH值<PI时，蛋白质带+电。通电后，蛋白质就会移动，直到某处的PH＝PI，蛋白质才呈电中性，不再移动，因此，可以测出PI。当前第3页\共有53页\编于星期六\11点蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，会使有规则的螺旋、球状等空间结构变为无规则的伸展肽链，从而引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。二、变性与复性当前第4页\共有53页\编于星期六\11点1、变性的实质：次级键的断裂，所以一级结构完好2、变性蛋白质的特点：生物活性丧失侧链基团暴露，水溶性降低易被蛋白酶水解（这就是熟食易于消化的道理）3、变性因素：物理因素：加热、高压、紫外线等化学因素：有机溶剂、脲、胍、强酸、强碱当前第5页\共有53页\编于星期六\11点变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。当前第6页\共有53页\编于星期六\11点3、复性：renaturation有的蛋白质变性后，将变性剂除掉，某些蛋白质缓慢重新回复到天然构像。例如，核糖核酸酶在β-巯基乙醇和8M尿素作用下发生的变性，经过透析去除尿素和β-巯基乙醇，酶蛋白又可恢复其原来的构象，生物学活性也几乎全部恢复。许多蛋白质变性时被破坏严重，不能恢复，称为不可逆性变性。

当前第7页\共有53页\编于星期六\11点三、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀（一）、蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是一种分散系统，在这种分散系统中，蛋白质是分散相，蛋白质分子量很大，一般在10000-1000000之间，在水溶液中分子直径在1-100nm之间，因此，蛋白质溶液是一种胶体溶液系统，从而具有胶体溶液的性质，如不能通过半透膜、电泳现象等。因此可用透析和电泳的方法来分离、纯化蛋白质。溶液分散系统根据分散程度可分为3类：真溶液——分散相质点小于1nm

悬浊液——分散相质点大于100nm

胶体溶液——分散相质点介于1-100nm当前第8页\共有53页\编于星期六\11点（1）蛋白质的分子大小在1~100nm之间，属于胶体质点的范围，在动力学上是稳定的；（2）水化层：蛋白质表面多亲水基团(-COOH、-OH、-SH、-CONH2

等），具有强烈地吸引水分子作用，在水溶液中蛋白质颗粒的表面形成一层很厚的水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集；（3）同性电荷：在非等电点时蛋白颗粒带有相同的净电荷，相互排斥，与其周围的反离子构成稳定的双电层。

维持蛋白质胶体稳定性的因素：当前第9页\共有53页\编于星期六\11点

破坏蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会凝聚成大的质点而从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀。(precipitation)。

（二）、蛋白质的沉淀反应当前第10页\共有53页\编于星期六\11点1、盐析法沉淀蛋白质的方法盐析(saltingout)——加盐使蛋白质沉淀析出的现象；原因：加入高浓度的中性盐（如[H4N]2SO4、Na2SO3

、NaCl等），可有效破坏蛋白质颗粒的水化层，同时又中和了蛋白质的电荷，使蛋白质产生沉淀；盐析法是最常用的分离蛋白质的方法；盐析一般不引起蛋白质的变性，当除去盐后又可以溶解。当前第11页\共有53页\编于星期六\11点用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。应用：血清中的球蛋白的提取当前第12页\共有53页\编于星期六\11点

可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。调节蛋白质溶液至等电点时，加入有机溶剂可加加速蛋白质沉淀。常温下有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备蛋白质。2、有机溶剂沉淀蛋白质

当前第13页\共有53页\编于星期六\11点当溶液pH值高于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，它易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）结合成不溶性盐而沉淀。重金属沉淀的蛋白质通常是变性的，误食重金属盐后可大量饮用牛奶或豆浆等蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。3、重金属盐沉淀蛋白质

当前第14页\共有53页\编于星期六\11点

pH小于等电点时蛋白质带正电荷，易与带负电（酸根阴离子）的生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)生成不溶性盐而沉淀。血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。4、生物碱试剂和某些酸类沉淀蛋白质当前第15页\共有53页\编于星期六\11点将接近于等电点的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固而沉淀。加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。

5、加热凝固当前第16页\共有53页\编于星期六\11点第二节蛋白质的分离、纯化和表征当前第17页\共有53页\编于星期六\11点一、分离提纯的一般程序：

蛋白质提纯的总目标--增加制品纯度或比活性、几增加单位蛋白质垂悬中所要蛋白质的含量或生物活血清中的球蛋白。分离提纯蛋白质的一般程序：前处理粗分离细分离重结晶当前第18页\共有53页\编于星期六\11点（1）前处理细菌动物组织植物组织超声波+砂研磨、高压挤压或溶菌酶破碎石英砂+提取液或纤维素酶破碎电动捣碎机、匀浆器、超声波破碎提取介质得到所要的蛋白质对于细胞核染色体、核糖体中的蛋白质分开差速离心当前第19页\共有53页\编于星期六\11点2).

粗级分离(常用沉淀法)

主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。常用以下方法：沉淀法除盐浓缩当前第20页\共有53页\编于星期六\11点（1）、硫酸铵分级盐析硫酸铵盐分子水化，夺走了蛋白质表面的水化层，蛋白质聚集沉淀。当前第21页\共有53页\编于星期六\11点（3）重金属盐沉淀

（4）、生物碱试剂与某些酸沉淀（2）、pI沉淀当前第22页\共有53页\编于星期六\11点

利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和盐分开。浓缩——用冻干、超滤等方法浓缩除盐——透析当前第23页\共有53页\编于星期六\11点3)、细分离以上方法得到的制剂可供工业应用。如需高纯样品，应精制4)、结晶：蛋白质分离纯化的最后步骤本身伴随着一定程度的提纯重结晶：可除去少量夹杂的蛋白质蛋白质纯度愈高、溶液愈浓就愈容易结晶样品进一步提纯的方法：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、电泳等。当前第24页\共有53页\编于星期六\11点二、蛋白质分离纯化方法（1）分子大小、（2）溶解度、（3）电荷、（4）吸附性质、（5）对其他分子的生物学亲和力当前第25页\共有53页\编于星期六\11点（一）、根据分子大小不同的纯化方法1、透析和超过滤透析超过滤滤膜压力过滤离心力过滤当前第26页\共有53页\编于星期六\11点在层析柱中装入葡聚糖凝胶颗粒。这种凝胶颗粒具有多孔的网状结构。这些网孔只允许较小的分子进入颗粒内，而大于网孔的分子则被排阻。当用洗脱液洗脱时，被排阻的相对分子质量大的分子先被洗脱下来，相对分子质量小的分子后下来。2、凝胶过滤（1）、凝胶过滤的介质当前第27页\共有53页\编于星期六\11点

（2）、凝胶过滤的原理当前第28页\共有53页\编于星期六\11点（二）利用溶解度差别的分离方法影响蛋白质溶解度的主要因素：溶液的pH离子强度介电常数温度当前第29页\共有53页\编于星期六\11点

蛋白质处于PI时，净电荷为零，相邻分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀1．等电点沉淀和PH控制不同蛋白质

∣

↓↓

等电点不同

∣

∣PI时溶解度最低

↓

将蛋白质彼此分开当前第30页\共有53页\编于星期六\11点2．蛋白质的盐溶和盐析中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响：盐溶——低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度在等电点时，中性盐K2SO4对一氧化碳血红蛋白的影响当前第31页\共有53页\编于星期六\11点作用机理：蛋白质吸附盐类离子，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，蛋白质与水分子的作用加强，溶解度提高。当前第32页\共有53页\编于星期六\11点原理－－大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水。降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析－－当离子强度增加到足够高时，如饱和或半饱和程度，很多蛋白质从水溶液中沉淀出来，这种现象叫盐析。盐析法－－分离、提纯常用方法。保持蛋白质的天然构象。（NH4)2SO4当前第33页\共有53页\编于星期六\11点血清半饱和硫酸铵离心球蛋白沉淀血清离心饱和硫酸铵白蛋白沉淀研究得最多的蛋白质之一——鸡蛋清的卵清蛋白就是用盐析法得到的：当前第34页\共有53页\编于星期六\11点3．有机溶解分级法如果：那么变性问题在很大程度上可以得到解决当前第35页\共有53页\编于星期六\11点作用原理：①.有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个相反电荷之间的吸引力，蛋白质的表面可离解基团的离子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。②.有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。

当前第36页\共有53页\编于星期六\11点4．温度对蛋白质溶解度的影响在40-50°C以上，大部分蛋白质变得不稳定,开始变性，一般在中性pH介质中失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定,因此蛋白质的操作一般在0°C或更低温度下进行。在0-40°C之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增大。当前第37页\共有53页\编于星期六\11点(三)根据电荷不同的分离纯化方法根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。1、电泳当前第38页\共有53页\编于星期六\11点当前第39页\共有53页\编于星期六\11点1)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。丙烯酰胺单体聚丙烯酰胺链N，N，N，N‘一四甲基乙二胺过硫酸铵交叉联接而形成凝胶N，N’一亚甲双丙烯酰胺调节单体的不同浓度不同程度交链结构当前第40页\共有53页\编于星期六\11点因此，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。那么如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率是不是就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。

连续的——整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的不连续的——电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。在聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为：当前第41页\共有53页\编于星期六\11点

1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂：十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用，当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别。这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。

当前第42页\共有53页\编于星期六\11点2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS）是一种阴离子去污剂，于100℃加热，在β-巯基乙醇存在下，可以使大多数多聚体蛋白质的四级结构解体，并与各亚基牢固地结合，从而遮蔽了蛋白质分子上原有电荷，同时带上强的负电荷。当前第43页\共有53页\编于星期六\11点由于所有的SDS-蛋白质复合物，在电泳时都以同样的电荷按分子量大小不同向正极移动，作SDS聚丙烯酰胺凝胶泳动（SDS）时，其泳动速度仅决定于蛋白质的分子量。SDS与蛋白质的结合是成比例的，所以SDS-蛋白质复合物在泳动中的不同速率，就反映了分子量的不同。与分子量的对数和相对迁移率成一定比例关系。使用已知分子量的标准物作标准曲线或用计算法确定标准曲线的常数，即可求出未知样品的分子量。用这种方法测定的分子量是亚单位肽链的分子量。当前第44页\共有53页\编于星期六\11点分子量及静电荷密度均影响泳动率只有分子量影响泳动率当前第45页\共有53页\编于星期六\11点

毛细管电泳技术是一种基于“不同组分在溶液中电泳迁移速度不同”的原理，利用电解槽和与之相连的毛细管对样品组成进行分离和检测的化学分析技术。3、毛细管电泳当前第46页\共有53页\编于星期六\11点4、等电聚焦

在外电场作用下，各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH梯度处。

当前第47页\共有53页\编于星期六\11点当样品中的蛋白质泳动至相等于其pI的pH位置时，其净电荷会变为零(pH=pI)，因而聚焦于该处不动。因此等电聚焦是依据分子pI的不同来作分离。pH梯度制作一般利用两性电解质Ampholyte，两性电解质是一种混合物，含有各种连续

pI的小分子。若在聚丙烯酰胺凝胶內加入ampholyte，通电后

ampholyte