肺癌个体化检测及质控

上海交通大学附属上海市胸科医院病理科

张杰肺癌个体化检测及质量控制当前第1页\共有74页\编于星期六\10点9345例手术切除肺癌标本分析

Female2761casesmale6584cases29.5%70.5%1:

2.38

当前第2页\共有74页\编于星期六\10点2004WHOLungCancerClassification

腺癌大细胞癌鳞癌腺鳞癌其它当前第3页\共有74页\编于星期六\10点腺癌8140/3腺癌，混合性亚型8255/3腺泡性腺癌8550/3乳头状腺癌8260/3细支气管肺泡癌8250/3非黏液性8252/3黏液性8253/3非黏液和黏液混合性8254/3实性腺癌伴有黏液产物8230/3胎儿性腺癌8333/3黏液性（“胶样”）癌8480/3黏液性囊腺癌8470/3印戒细胞腺癌8490/3透明细胞腺癌8310/3

肺癌的WHO组织学分类（2004年）当前第4页\共有74页\编于星期六\10点

浸润前病变非典型腺瘤性增生

原位腺癌（≤3cm原来的BAC）非黏液性黏液性黏液/非黏液混合性微浸润性腺癌（≤3cm贴壁状为主的肿瘤，浸润灶≤5mm）非黏液性黏液性黏液/非黏液混合性浸润性腺癌

贴壁状为主（原来的非黏液性BAC生长方式，浸润灶＞5mm）

腺泡性为主乳头状为主微乳头状为主

实性为主伴有黏液产物浸润性腺癌变型:浸润性黏液腺癌（原来的黏液性BAC）胶样型胎儿型（低度和高度恶性）肠型肺腺癌的IASLC/ATS/ERS分（2011年）当前第5页\共有74页\编于星期六\10点小活检和/或细胞学标本难以进一步分型，通常诊断为非特指性NSCLC（NSCLC-NOS）提出借助于免疫组织化学（TTF-1、p63(p40)等）尽可能将NSCLC区分为倾向腺癌和倾向鳞状细胞癌，以提供药物治疗的选择肺腺癌对多靶点抗叶酸药物培美曲赛（pemetrexed）和抗血管内皮生成药物贝伐单抗（bevacizumab）治疗有效，而鳞状细胞癌对培美曲赛治疗效果不如腺癌，用贝伐单抗治疗可引起威胁生命的大出血小活检和细胞学诊断肺癌当前第6页\共有74页\编于星期六\10点TTF-1

鳞癌?腺癌?当前第7页\共有74页\编于星期六\10点

鳞癌?腺癌?P63(p40)

当前第8页\共有74页\编于星期六\10点小活检和细胞学标本除用于病理诊断外，要适当留存一些标本做分子检测（基因突变、扩增和染色体易位等）新分类还推荐如有可能，细胞学检查最好与小活检细胞学检测一起进行，以提高诊断准确性细胞学是一个有用的诊断方法，尤其是和组织学相结合时从细胞穿刺或胸腹水标本中保存细胞包埋块（cellblock)，用于分子检测小活检和细胞学诊断肺癌当前第9页\共有74页\编于星期六\10点2011年NCCN非小细胞肺癌治疗指南（中文版）当前第10页\共有74页\编于星期六\10点

2012

NCCN指南推荐所有NSCLC患者进行检测

中国版NCCN指南与美国版NCCN指南的区别：除了腺癌、大细胞癌和未分类的NSCLC患者，中国版NCCN指南要求鳞癌也要进行EGFR突变检测当前第11页\共有74页\编于星期六\10点2013

NCCN指南推荐更新，EGFR检测更为重要2013NCCN指南与既往不同在于：未知人群减少，腺癌/大细胞癌患者均需要做检测为I类证据/不吸烟鳞癌也可以EGFR突变检测当前第12页\共有74页\编于星期六\10点卫生部原发性肺癌诊疗规范（2011）当前第13页\共有74页\编于星期六\10点NatureReview2007,7:169非小细胞肺癌中药敏相关的EGFR突变当前第14页\共有74页\编于星期六\10点外显子19，21突变为常见EGFR敏感突变类型DacicS.AdvAnatPathol2008;15:241-247.RielyGJ,etal.ClinCancerRes2006;12(24):7232-7241.MurrayS,etal.JThoracOncol2008;3:832-839.对EGFR-TKI的反应外显子突变分布频率敏感18G719X4%19缺失50%21L858RL861X40%耐药20T790MD770_N771insNPG6%当前第15页\共有74页\编于星期六\10点肺癌与EGFR

目前国内开展EGFR检测的单位逐渐增多有关中国人EGFR基因突变研究的报道增多2011年中华病理学杂志发表了“关于EGFR突变检测共识”2011年11月15日1成立卫生部分子病理质控中心当前第16页\共有74页\编于星期六\10点项目孙孟红王芳冯勤王立帅赵静范苗静张杰合计技术测序TagManPCR优化PCRARMS测序测序测序总数目29914103092651922824543211突变率42.2%28.4%34%30.2%33.3%42.6%48.2%37%吸烟与突变非吸烟／37.6%40.2%41%50%54.3%52.7%46%吸烟／14.4%22.2%15.2%9%32.9%41.1%22.5%性别男33.7%19.8%30.4%22.6%20.9%36%39.5%29%女53.5%43.2%39.2%39.7%51.9%51.3%59.6%48.3%(中华病理学杂志2011年10期）当前第17页\共有74页\编于星期六\10点项目孙孟红王芳冯勤王立帅赵静范苗静张杰合计外显子分布182%／5.7%／／4.1%3.9%1948.7%48.1%39%40%60.9%48.4%53.9%48.4%206.7%／／6%／6.43%6.4%2142.5%51.8%55.2%54%39.1%51.6%44.3%48.2%组织分型腺癌46.5%33.5%38.8%37.8%37.9%47.8%56.8%42.7%BAC／61.3%／58.5%73%47.1%普通／32.4%／37.9%／／鳞癌13.3%／22.2%／7.5%23.6%10.3%15.4%腺鳞癌7／13／4／8／2／67／910／18大细胞癌／／3／14／1／5／10／31其他／／／／5／／(中华病理学杂志2011年10期）当前第18页\共有74页\编于星期六\10点EML4-ALK检测：方法概述当前第19页\共有74页\编于星期六\10点荧光原位杂交

(FISH)当前第20页\共有74页\编于星期六\10点逆转录-聚合酶链反应

(RT-PCR)当前第21页\共有74页\编于星期六\10点Ⅰ期临床结果再回顾当前第22页\共有74页\编于星期六\10点三种检测方法比较当前第23页\共有74页\编于星期六\10点FISH、IHC和RT-PCR比较参数表FISHIHCRT-PCR灵敏度分离信号细微使用检测增强装置后灵敏度可提高高检测到未知的变异体是是否可否区分融合类型否否是工作强度大是否否要求非常专业的培训是否否结果判读人为主观影响大大小同时细胞形态可视化否是否在专业机构外广泛使用否是否AdaptedfromMitsudomi,IASLC2011;Abs#MTE22.1Hirsch,IASLC2011;Abs#O05.08当前第24页\共有74页\编于星期六\10点ROS1基因与NSCLCROS1基因位于6号染色体长臂22（6q22）共有43外显子其mRNA全长7638bp当前第25页\共有74页\编于星期六\10点ROS受体酪氨酸激酶的靶向治疗原理FN-III

likerepeatsTK

domainROS在脑、肺、胃、乳腺和肝肿瘤/细胞系中的过表达在结肠癌和肾癌细胞系中ROS突变肿瘤中发现的ROS

融合FIG-ROS：恶性胶质瘤细胞系SCL34A2-ROS:非小细胞肺癌细胞系CD74-ROS:非小细胞肺癌患者克唑替尼可抑制ROS

融合基因细胞系的

生长StructureofROSEl-Deebetal.,MedResRev.2010epub当前第26页\共有74页\编于星期六\10点当前第27页\共有74页\编于星期六\10点当前第28页\共有74页\编于星期六\10点当前第29页\共有74页\编于星期六\10点当前第30页\共有74页\编于星期六\10点克唑替尼:概述名称:PF-02341066通用名:克唑替尼商品名:XALKORITM化学式:C21H22Cl2FN5O作用机制:竞争性ATP抑制剂主要靶点:ALK、c-Met、ROS2011年8月26日美国FDA批准用于ALK阳性非小细胞肺癌克唑替尼在ALKATP结合部位Pfizer,dataonfile当前第31页\共有74页\编于星期六\10点当前第32页\共有74页\编于星期六\10点ROS1基因重排ROS1的重排成为了一种继成功发现肺癌突变基因KRAS（占25%）、EGFR（占10-15%）、ALK（占4%）后，再一次发现最新的肺癌基因突变ROS1。ROS1基因突变的癌症患者常见于年龄偏小，不吸烟，病理类型为腺癌的肺癌。由ROS1基因重新排列引起的癌症在非小细胞肺癌中占1%。ROS1重排可引起癌基因ROS1融合激酶的表达及对ROS激酶抑制剂敏感性。Crizotinib作为C-MET、ALK及ROS的小分子酪氨酸激酶抑制剂可能成为进展期非小细胞肺癌有效治疗药物。该药物已经获准用于局部进展期和转移性ALK阳性的非小细胞肺癌患者的治疗。当前第33页\共有74页\编于星期六\10点分子靶向基因检测质量问题实验室：达标人员资质标准化检测人员上岗培训、上岗证书报告签发人员资质、分子病理医师实验条件；检测方法：方法越是灵敏，抗污染的问题越是突出

标本来源：不同的标本，应相对采用不同的检测方法当前第34页\共有74页\编于星期六\10点分子病理实验室质量要求

二.PCR实验室要达标，通过国家验证

检测结果要做室间比对

国际间的室间比对(

EMQN,ESP,ETOPandESMO)分子病理实验室要通过ISO15189认可当前第35页\共有74页\编于星期六\10点临床标本与研究标本的差异标本类型肿瘤细胞含量标本处理其他分析前、分析后处理实际临床标本新鲜组织、蜡块、穿刺组织、脱落细胞等随意性大，无严格要求固定方式、试剂、标本离体时间各异不定研究标本统一要求要求统一，被病理所确认统一的保存以及运送条件尽量统一当前第36页\共有74页\编于星期六\10点分子检测与靶向治疗的关键步骤根据结果制定

治疗方案临床采集合适的

组织标本选择合适的检测方法123当前第37页\共有74页\编于星期六\10点分子检测与靶向治疗的关键步骤根据结果制定

治疗方案临床采集合适的

组织标本选择合适的检测方法123当前第38页\共有74页\编于星期六\10点标本来源

手术切除标本气管镜活检标本经皮穿刺标本淋巴结穿刺标本胸水/心包细胞学标本血清DNA标本及循环细胞标本相关问题标本异质性标本类型标本的收集和储存标本是获得高质量检测结果的重要前提当前第39页\共有74页\编于星期六\10点常用标本获取方法CT引导下肺穿刺活检模拟气管镜引导下经支气管镜肺组织活检(VB-TBLB)经气管镜超声引导下活检(EBUS)锁骨上淋巴结穿刺活检胸腔闭式引流术心包穿刺术外科开胸手术活检胸腔镜活检纵隔镜活检微创手术活检当前第40页\共有74页\编于星期六\10点取样中存在的问题肿瘤的位置肿瘤生长的部位有时难以进行内科穿刺活检，需要依靠外科手术活检取材细针穿刺时使用的器材尺寸可能影响细胞的获取量及DNA的质量由于无法保证每次都能取得足够的标本，需要一些适用于小标本的检测方法当前第41页\共有74页\编于星期六\10点肿瘤标本获取的主要途径手术(切除/切取)支气管镜(活检：中央型)穿刺(活检：周围型)制备蜡块切片HE染色确认癌细胞以临床医生认为最容易获取的方式原发病灶/转移灶肿瘤组织胸水等标本的获取当前第42页\共有74页\编于星期六\10点标本的获取：以穿刺为例可行性评估根据病灶位置选择合适的穿刺手段复杂情况的处理

严重水肿基底部位呼吸动度较大部位的肿块肿块内部支气管充气征明显肿瘤内血管丰富

基底部位呼吸动度较大部位的肿块肿瘤内血管丰富严重水肿肿块内部支气管充气征明显当前第43页\共有74页\编于星期六\10点标本的获取对周围型病变，TBLB创伤小，可重复性强，是一种相对安全有效的检查方法，但TBLB取材大小受器械规格限制，活检组织易受挤压变形而影响检测结果1锁骨上淋巴结穿刺活检是一种便捷有效的临床技术，检出率高，副反应小2，但仅能提供细胞学样本。EBUS可通过中央气道取的组织，诊断迅速，并发症少，是一种安全性较好的活检方法。对肺癌和其他纵膈恶性疾病诊断价值高，并可协助分期3胸腔闭式引流术和心包穿刺术并发症少，容易为患者接受，术前需行超声定位，可在超声引导或CT引导下进行4,5。但引流获得标本需进一步富集。外科方法可获取大量、新鲜样本，但创伤较大或费用昂贵当前第44页\共有74页\编于星期六\10点经支气管肺活检肿瘤

<正常细胞的5%CT引导穿刺肺癌的活检标本通常仅含有少量肿瘤细胞当前第45页\共有74页\编于星期六\10点适宜的切片：HE片确认*，癌细胞数≥200个(不推荐依经验盲取)常规切片(4~5μm厚，普通载玻片)连续切片8~10张刀片：一次性(不推荐交叉使用)标本处理

：离体后处理：及时切开、固定(尽快)固定液：10%中性福尔马林(pH≈7.0)(不推荐使用任何其它溶液)固定液量：≥10倍体积固定时间：6~48小时如何获取优质标本：标本处理当前第46页\共有74页\编于星期六\10点如何获取优质的标本：标本类型石蜡组织：尽可能送检一年内的石蜡标本石蜡切片：含肿瘤细胞越多越好(50%以上)；组织部位面积约6mmx6mm以上包埋组织：组织块不小于0.5×0.5×0.5(cm)新鲜组织：比石蜡等处理过的旧组织，DNA保存得更完整，对PCR实验更有利，但一定要经病理学确认含有肿瘤组织50%以上；重量≥10ｍg(约米粒大小以上)，经PBS或生理盐水冲洗干净取癌组织的中心位置组织块(避开坏死区域)，固定于10%中性福尔马林溶液中，尽快送病理科要有病理学诊断只要能获得足够的癌细胞，各种取材方式均可对于复发的患者，再次活检不仅可确诊，还可以获得分子标志物的信息当前第47页\共有74页\编于星期六\10点如何获取优质的标本：标本类型尽可能取得大标本进行检测临床常用的取样方法取得标本量通常较少内镜活检、穿刺活检、细胞学标本(支气管刷检,细针穿刺)小标本检测失败率53–66%(内镜活检与穿刺活检)，而切除活检标本的失败率仅24%标本中肿瘤细胞的含量也十分重要组织标本富集细胞学标本富集直接测序要求使用肿瘤细胞含量较高(50–70%)的标本EberhardDA,etal.JClinOncol2008;26:983-984.当前第48页\共有74页\编于星期六\10点分子水平的肺癌细胞存在异质性

肿瘤内异质性

原发部位与转移部位的异质性如何获取优质的标本：标本异质性EberhardDA,etal.JClinOncol2008;26:983-984.肿瘤异质性可能影响研究结果如果可行，至少取得3个代表性部位的标本进行检测当前第49页\共有74页\编于星期六\10点如何获取优质的标本：标本的采集和储存经福尔马林固定处理的标本可能存在以下问题

核酸分解片段长度缩短干扰PCR结果固定标本中可能存在序列改变EberhardDA,etal.JClinOncol2008;26:983-984.尽量采用新鲜冰冻组织采用标准浓度的固定液(10%中性福尔马林缓冲液

，8–24小时)记录固定液标本以原始大小保存，而不是切片保存如果是切片标本，应记录切片时间

当前第50页\共有74页\编于星期六\10点如何获取优质的标本：标本含量一些突变患者可能没有被检测到(假阴性)取决于检测方法的敏感度为保证DNA测序的敏感性，要求检测标本中肿瘤细胞≥50%当前第51页\共有74页\编于星期六\10点分子检测与靶向治疗的关键步骤根据结果制定

治疗方案临床采集合适的

组织标本选择合适的检测方法123当前第52页\共有74页\编于星期六\10点基因突变检测影响因素---方法学因素ME-PCR/SequencingO=产物转移/加入试剂/开管操作qPCR:

Real-time

DetectionPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingPCRPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingPCRHetero-

duplexCapillaryElectro-phoresisARMS&PNA-LNAclampPCR/SequencingNestedPCR/SequencingPCR/

HRMA/

dHPLCPCR/

RFLPPCRRFLPElectro-phoresisSizingPCRPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingRFLPOOOOOOOOOOOOTaqMan

Clean-upOClean-upOClean-upOOOOPCRSURVEYORcleavagedHPLCSizingOConfirmationbysequencingPCR/

SURVEYORPCRClean-upPyro-sequencingRxnPyroSequencingOO123456Steps7ConfirmationbysequencingOConfirmationbysequencingOOO1%~10%3-10%10%3-12%20~30%20~30%<1%qPCR:

Real-time

Detection~10%当前第53页\共有74页\编于星期六\10点直接测序法当前第54页\共有74页\编于星期六\10点荧光定量PCR当前第55页\共有74页\编于星期六\10点石蜡切片显微切割Scorpions-ARMSIPASS当前第56页\共有74页\编于星期六\10点ARMSvs.DNA测序中华病理学杂志2008;37(5):294-9.结果检出率成功率共计可分析不可分析突变无突变ScorpionsARMS**4240051.2%100%82例直接测序***25332430.5%70.7%82例*肺癌手术石蜡切片标本检测EGFR基因突变**IPASS方法学

***INTEREST方法学当前第57页\共有74页\编于星期六\10点ARMSvs.DNA测序测序法ARMS敏感度25%1%石蜡组织标本成功率低高商用试剂盒无有流程与速度复杂/慢简单/快数据分析要求高低试剂成本相对低相对高仪器成本高低1.DacicS.AdvAnatPathol2008;15(4):241-247.2.中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家组.中华病理学杂志2011;40(10):700-702.当前第58页\共有74页\编于星期六\10点当前第59页\共有74页\编于星期六\10点当前第60页\共有74页\编于星期六\10点当前第61页\共有74页\编于星期六\10点EGFR基因突变检测方法的选择DNA测序在部分地区仍然是EGFR检测的金标准其他方法，比如ARMS可能比直接测序更敏感，目前已被广泛应用新的EGFR基因检测方法层出不穷，其检验效能有待进一步考证优化检测途径，最大限度提高检测敏感性、降低假阳性和假阴性率以获得可靠的检测结果对每个患者来说都至关重要当前第62页\共有74页\编于星期六\10点

关于EGFR突变检测共识（中华病理学杂志2011年10期）关于EGFR检测时间活检：1小时内送病理科及时固定于4%中性甲醛中小标本6-12h大标本6-48h病理报告3个工作日（包括免疫组化）EGFR5-7个工作日总共10个工作日，完成全部诊断和检测工作当前第63页\共有74页\编于星期六\10点

关于EGFR突变检测共识DNA提取：

PCR扩增成败最关键步骤

建议采用正规公司的DNA提取试剂盒

DNA提取质量比数量更为重要建议对提取DNA模板做质量检测OD值DNA标本质量不符质量，阳性则罢阴性要注明。组织切片中要有200-400个细胞5-10um切片

10张当前第64页\共有74页\编于星