蛋白质组与蛋白质组学

蛋白质组与蛋白质组学第一页，共四十五页，编辑于2023年，星期二蛋白质组学DNAmRNA蛋白质转录翻译基因蛋白质细胞特异性基因表达生理状态蛋白质相互作用温度应激状态培养条件药物作用数量有限结构相对稳定复杂性多变性直接反应生命现象复杂的调控第二页，共四十五页，编辑于2023年，星期二蛋白质组与蛋白质组学的定义

蛋白质组

protein+genomeproteome

一种基因组所表达的全套蛋白质一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质第三页，共四十五页，编辑于2023年，星期二蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律

一、蛋白质组与蛋白质组学的定义第四页，共四十五页，编辑于2023年，星期二蛋白质组及其质点的分离与分析

第五页，共四十五页，编辑于2023年，星期二

根据蛋白质溶解度、分子大小及形状、电离性质、生物学功能的差异进行：

1、根据溶解度

2、根据分子量透析和超滤平衡离心凝胶过滤层析

（三）蛋白质混合物的分离方法一、分离纯化第六页，共四十五页，编辑于2023年，星期二第七页，共四十五页，编辑于2023年，星期二第八页，共四十五页，编辑于2023年，星期二3、根据电荷毛细管电泳离子交换层析一、分离纯化第九页，共四十五页，编辑于2023年，星期二4、根据蛋白质的亲和能力亲和层析第十页，共四十五页，编辑于2023年，星期二（四）蛋白质分离纯化的条件缓冲液盐、金属离子和螯合剂还原剂去垢剂蛋白酶抑制剂表面效应蛋白质的环境因素温度储存

一、分离纯化第十一页，共四十五页，编辑于2023年，星期二二、分析鉴定（一）Western印迹技术基本操作步骤：蛋白样品的制备

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质的电转移蛋白质与抗体的结合反应目标蛋白质的显示western印迹基本步骤图示第十二页，共四十五页，编辑于2023年，星期二Western免疫印迹用于测定特定蛋白质的大小和含量基本原理将经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至固相支持体上，以针对特定蛋白质的抗体作为探针，与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位进行特异性反应，结合上的抗体可用二抗检测。常用的二抗是与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白或A蛋白；实际应用中常常还需要设置适当的对照。第十三页，共四十五页，编辑于2023年，星期二常需要内参蛋白量化蛋白量；GAPDH、ACTIN、ALBUMIN……第十四页，共四十五页，编辑于2023年，星期二

将SDS的高分辨能力与抗原抗体反应的特异性、敏感性相结合(灵敏度达到ng级)

蛋白电泳在变性条件下进行，消除了蛋白溶解、聚集以及与外来蛋白共沉淀等问题特点第十五页，共四十五页，编辑于2023年，星期二免疫荧光法(immunofluorescence)主要用于检测目的蛋白在细胞内的定位。基本原理将待检的目的蛋白作为抗原，固定在载玻片上，先加上针对目的蛋白的抗体(第一抗体)进行反应，再加上针对第一抗体的荧光素标记抗体(第二抗体)进行反应，称作间接免疫荧光法。如果将荧光素标记在第一抗体上，则不用再加第二抗体，称作直接免疫荧光法。特点需要在荧光显微镜下观察结果；无法检测目的蛋白的大小；操作简便，但需设立必要的对照；第十六页，共四十五页，编辑于2023年，星期二免疫荧光法(immunofluorescence)例1例2第十七页，共四十五页，编辑于2023年，星期二免疫沉淀(immunoprecipitation)技术将抗体加入蛋白混合溶液，使之与相应抗原结合；加入固定的抗体结合蛋白(如:ProteinA-琼脂糖珠)；经离心后，与ProteinA结合的抗原-抗体复合物便可沉淀；将样品变性后即可获得游离的抗原蛋白；基本步骤基本原理利用一种可离心沉淀的抗体结合蛋白(如ProteinA,ProteinG等)，将抗原-抗体复合物从蛋白混合溶液中分离，进行定量或定性研究。为方便后续分析，在免疫沉淀前，常会对抗原进行标记。第十八页，共四十五页，编辑于2023年，星期二免疫共沉淀(co-IP)技术

基于与蛋白质X的生理性相互作用，如果用蛋白X的抗体免疫沉淀X，则蛋白质Y也可能沉淀下来。Y的这种免疫沉淀被称为免疫共沉淀(co-immunocipitation,Co-IP)，此法最常用于测定两种目标蛋白质在体内的结合。YABY裂解细胞免疫共沉淀蛋白质X第十九页，共四十五页，编辑于2023年，星期二（二）二维凝胶电泳（2-DE)

是目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一由两相组成：第一相：等电聚焦凝胶电泳根据蛋白质电荷差异第二相：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质分子量差异二、分析鉴定第二十页，共四十五页，编辑于2023年，星期二二维双向电泳(2Delectrophoresis)

基本原理基于等电点与分子量分离蛋白质IEF-focusedproteinsSDS-chargedproteinsinIPGstripSDS-chargedproteinsresolvedaccordingtosizesinSDSgel第二十一页，共四十五页，编辑于2023年，星期二2-DE原理示意图二、分析鉴定第二十二页，共四十五页，编辑于2023年，星期二2-DE分析的基本步骤蛋白质溶解变性还原去除蛋白质杂志利用不同pK固定化电解质可配置不同pH范围的凝胶或利用商业化软件设计

第一相电泳：IPG－IFE平衡第二相电泳：SDS－PAGE考马斯亮蓝染色、银染色、铜染色样品制备IPG胶制备双相电泳染色二、分析鉴定第二十三页，共四十五页，编辑于2023年，星期二2-DE获得的蛋白质图谱

二、分析鉴定第二十四页，共四十五页，编辑于2023年，星期二优点：可以同时直观显示数千个蛋白质点；缺点：耗时，耗力，目前无法自动化；难以分离疏水、具极端分子量或等电点的蛋白质（如膜受体蛋白、组蛋白等）。二维双向电泳(2Delectrophoresis)silverstaining(~3000spots)第二十五页，共四十五页，编辑于2023年，星期二蛋白质染色考马斯亮蓝染色银染：灵敏度高；“雪崩”效应；末端封闭铜染第二十六页，共四十五页，编辑于2023年，星期二

通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。

(三)图像分析技术二、分析鉴定第二十七页，共四十五页，编辑于2023年，星期二2-DE图像分析软件包操作过程：

图像采集斑点检测背景消减获得蛋白质相关信息图像内及图像间的比较二、分析鉴定第二十八页，共四十五页，编辑于2023年，星期二

放射性核素标记亲和标签法正常细胞D0亲和标签病理细胞D8亲和标签混合并消化生物素亲和纯化液相色谱－质谱联用分析测量两个不同样品中蛋白质的相对丰度二、分析鉴定第二十九页，共四十五页，编辑于2023年，星期二蛋白芯片(proteinchip)技术

将一系列“诱饵”蛋白以阵列方式固定在经过特殊处理的底板上，然后将其与待分析的样品杂交，只有那些和“诱饵”结合的蛋白才被保留在芯片上。其实质是酶联免疫吸附测定。基于蛋白质表面化学及质谱检测的高通量蛋白质分析技术第三十页，共四十五页，编辑于2023年，星期二蛋白芯片(proteinchip)技术基本方法

蛋白质的结合：未经处理的样品(如血清，尿液等)直接点在芯片上，根据芯片表面不同的化学或生物特性结合相应的蛋白质；

清洗减少非特异性蛋白(如盐及其它污染物)的结合；

加能量吸收分子(EAM)：EAM能有效的吸收激光的能量，使样品分子进入气相并得到电离；

用表面增强的激光解吸电离法(SELDI)将保留在芯片上的蛋白质洗脱下来；

电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定它们的质量；第三十一页，共四十五页，编辑于2023年，星期二蛋白芯片(proteinchip)技术从未经提纯的生物或临床样品中直接捕获、检测和分析蛋白质不需任何标记或加尾

超高的检测灵敏度(1-50fmole的蛋白质)

从超小样品体积(0.5µl)到大体积(400µl)

快速获取实验结果第三十二页，共四十五页，编辑于2023年，星期二蛋白芯片(proteinchip)技术ProteinChip的应用第三十三页，共四十五页，编辑于2023年，星期二蛋白质芯片第三十四页，共四十五页，编辑于2023年，星期二原理样品分子离子化后，根据不同离子间的质量和电荷比值（质荷比，m/e）的差异确定分子量。应用蛋白质的序列分析研究蛋白质的修饰（五）质谱技术二、分析鉴定

第三十五页，共四十五页，编辑于2023年，星期二（六）其它方法Edman降解法测定蛋白质多肽的排列顺序。核磁共振（NMR）、荧光光谱法测定溶液中蛋白质分子的结构。X射线衍射分析法、小角中子衍射法测定晶体蛋白质的分子结构等。二、分析鉴定第三十六页，共四十五页，编辑于2023年，星期二蛋白质数据库及其应用

第三十七页，共四十五页，编辑于2023年，星期二蛋白质数据库及其应用二、蛋白质数据库的应用

一、蛋白质数据库(ProteinDatabase)第三十八页，共四十五页，编辑于2023年，星期二一、蛋白质数据库（一）蛋白质序列数据库（二）蛋白质结构数据库（三）蛋白质直系同源簇数据库（四）DIP数据库第三十九页，共四十五页，编辑于2023年，星期二一、蛋白质数据库（一）蛋白质序列数据库

SWISS-PROT数据库：

http://www.ebi.ac.uk/swissprotPIR和PSD数据库

//pir第四十页，共四十五页，编辑于2023年，星期二

蛋白质数据仓库

/pdb/

蛋白质结构分类数据库

http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/PROSITE数据库

http://www.expasy.ch/proside/（二）蛋白质结构数据库一、蛋