疾病易感性与基因多态性研究进展

疾病易感性与基因多态性研究进展卫生毒理教研室主要内容一、疾病易感性与高危人群二、基因多态性的概念、生物学作用与意义

三、基因多态性的检测方法

四、关于基因多态性与疾病易感性关系研究的现状五、目前基因多态性研究中存在的问题及对策六、展望

环境污染对人类健康的威胁日趋严重有关资料统计，由于先天的遗传因素，造成胎儿畸形占10%-15%，环境因素则占10%-20%，其它为遗传基因和环境因素的联合作用。目前已发现具有致畸作用的环境化学污染物有甲基汞、四氯二苯、五氯酚钠和有机磷杀虫剂等。Disease环境暴露Exposure

？遗传因素HumanGenomeProject

人类基因组计划（1990-）一、易感基因与高危人群人们发现在同一环境因素变化条件下，有的人反应强烈，出现患病甚至死亡，有的人反应不大。例如，同是钢铁厂的冶炼工或电焊工，同在一个车间工作，同样的作业环境，仅有部分人发生锰中毒。这说明不同个体对环境有害因素易感性存在差异。决定某个体对某种疾病易感性的基因称为易感基因。对环境因素损害敏感的那部分人群称为高危险人群，在同一污染环境中，高危险人群比正常人出现健康危害早而且程度也严重。在任何居民群体中都有高危险人群，而且所有的健康人，在其一生的不同年龄段，不同环境条件下，都有某一时间处于高危险状态的可能。TheBeginning“Wehavejuststartedtherealjourneytowardsfullyunderstandingbiologicaldiversitiesaroundusfromitsfundamentalbuildingblocks,theDNA”二、基因多态性的概念、生物学作用与意义1突变(mutation)

DNA永久的结构改变。在大多数情况下，这样的DNA变化或者没有影响或者导致伤害，但是有时突变能改善生物体生存的机会，将有利的突变传给后代。

2在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因的多态性(genepolymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(sitepolymorphism)和长度多态性

(lengthpolymorphism)。（一）基因突变与基因多态性位点多态性：是由于等位基因之间在特定的位点上DNA序列存在差异，也就是基因组中散在的碱基的不同，包括点突变（转换和颠换），单个碱基的置换、缺失和插入。突变是基因多态性的一种特殊形式，单个碱基的置换又称为单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。据估计，单碱基变异的频率在1/1000-2/1000。SNP在基因组中数量巨大，分布频密，检测易于自动化和批量化，被认为是新一代的遗传标记。AmutationintheDNAsequencewithafrequencyof>1%单核苷酸多态性(ＳＮＰｓ)是指个体基因组内特定核苷酸位置上的单个碱基发生突变,这种突变包括单碱基的转换、颠换、插入或缺失等。严格来说,只有当等位基因的频率大于或等于1%时才能称得上是ＳＮＰｓ,然而部分ＳＮＰｓ数据库如ＨＧＶBase把等位基因的频率小于1%的变异也包括在ＳＮＰｓ内(见ＨＧＶBase数据库首页说明)。研究表明,人类每对等位染色体上每1000ｂｐ就会出现1个ＳＮＰｓ,而整个人类基因组每300ｂｐ就会出现1个ＳＮＰｓ。这样在任意两个个体之间,就有好几百万的单碱基差异和十万个氨基酸的不同,所以ＳＮＰｓ在一定程度上反映了人类个体或群体的特异性。长度多态性：一类为可变数目的重复序列（variablenumberoftandemrepeats,VNTRS），它是由于相同的重复顺序重复次数不同所致，它决定了小卫星（minisatellite）DNA长度的多态性。小卫星是由15-65bp的基本单位而成，重复次数在人群中是高度变异的。另一类长度多态性是由于基因的某一片段的缺失或插入所致，如微卫星DNA（microsatellite），它们是由重复序列构成，基本序列只有1-8bp,如(TA)n及(CGG)n等，通常重复10-60次。长度多态性是按照孟德尔方式遗传的，它们在基因定位、DNA指纹分析，遗传病的分析和诊断中被广泛地应用。99%ofoneindividualDNAsequenceswillbeidenticaltothatofanotherperson.Ofthe1%difference,over90%willbesinglenucleotidepolymorphisms(SNPs).GeneticVariationsSNPsDeletionsInsertionsMicrosatelliteMinisatellite（二）基因多态性的生物学作用与意义1生物学作用（1）遗传密码的改变错义突变(missensemutation)、无义突变(nonsensemutation)、同义突变(samesensemutation)、移码突变(frame-shiftingmutation)

（2）对mRNA剪接的影响：如果点突变发生在内含子的剪切位点，可以产生两种影响：一是原有的剪接位点消失，二是产生新的剪切位点。无论是那一种形式，都可以导致mRNA的错误剪接，产生异常的mRNA，最终产生异常的表达产物，数个碱基的缺失、片段缺失等均有可能造成剪接位点的缺失。（3）蛋白质肽链中的片段缺失：无义突变和DNA片段的缺失都可以导致肽链中的片段缺失，致使基因编码的蛋白质失去原有的功能。移码突变不仅翻译后的肽链中氨基酸序列发生改变，而且也导致肽链中的大片段缺失。（4）启动子的突变及非转录区的突变：可以使基因的转录水平或活性增强或降低。

2基因多态性的生物学意义

在预防医学方面，基因多态性的研究涉及的范围广泛，包括基因多态性与病因未知的疾病关系的研究，也包括对已知特定环境因素致病易感基因的筛选。因此开展我国人群的基因多态性与环境的作用关系的研究具有重要的意义。而基因多态性的研究在职业病医学中则更具有实际的意义。对易感基因和易感性生物标志物的分析，将某些携带敏感基因型的人甄别开来，采取针对性预防措施，提高预防职业性危害工作的效率。对特定的污染物易感人群和耐受人群的基因多态性研究，有助于阐明环境因素的致病机制，也推动了遗传易感性标志物的研究。三、基因多态性的检测方法

到目前为止，DNA水平遗传多态性标记物的研究已经历了三个阶段。

1

限制性片段长度多态性标记（RFLP），这是第一代DNA遗传标记，是D.Botstein于1980年提出的。RFLP的原理：如果存在DNA的多态性，会使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性。最早是用SouthernBlot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。

基于ＰＣＲ、酶切的方法除了以上的RFLP还有随机扩增多态性ＤＮＡ(ＲＡＰＤ)ＰＣＲ-ＲＦＬＰ是通过专一识别性内切酶处理ＰＣＲ产物,电泳后检测分型ＲＡＰＤ利用随机引物(约10ｂｐ)对基因组进行扩增,寻找特征性条带和分型;此外,还有突变酶学检测(ＥＭＤ)和扩增阻滞突变系统(ＡＲＭＳ)等。

2DNA重复序列的多态性标记重复序列的多态性有小卫星DNA多态性和微卫星的DNA多态性等多种。

3

单核苷酸多态性标记（SNP,singlenucleotidepolymorphism），是1996年被美国的E.Lander提出的，被称为“第三代DNA遗传标记”。其分析的经典方法是采用PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）分析、RFLP、温度梯度凝胶电泳（TGGE）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、变性高效液相色谱(dHPLC)和高通量基因芯片技术(HA)等。

（1）单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。经ＰＣＲ扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经高温处理使之解链并保证在单链状态下,然后在一定浓度的非变性聚丙稀酰胺凝胶中电泳,单链ＤＮＡ迁移率除与ＤＮＡ浓度有关外,更主要取决于ＤＮＡ单链所形成的空间构象,相同长度的单链ＤＮＡ,可以因其顺序或单个碱基差异,所形成的空间构象就会不同,其在凝胶中泳动速度不一样,从而显示出带型的差异,即多态型。(2)温度梯度凝胶电泳(ＴＧＧＥ)

该方法主要是根据带点突变和正常ＤＮＡ片断由于Ｔｍ值的不同将表现出不同的解链行为,ＤＮＡ片断在聚丙稀酰胺凝胶电泳中通过设置温度梯度来进行分离,片段到达最低熔解区即开始解链,使片断呈Ｙ字结构,因而降低其迁移速率。一个碱基的不同足以导致迁移速率的不同。该法可用于200～900ｂｐ内的ＤＮＡ片断,检出率达100%,其Ｔｍ值可通过软件预测。

(3)变性梯度凝胶电泳(ＤＧＧＥ)ＤＧＧＥ是利用ＤＮＡ在一定梯度变性剂浓度的凝胶中电泳时,有突变和无突变会在不同的地方开始解链,从而达到分离的目的。ＤＧＧＥ与ＴＧＧＥ类似,前者是依靠变性剂使Ｔｍ值不同的分子分离,而后者是依靠温度梯度分离Ｔｍ值不同的分子。ＤＧＧＥ检测的片断长度可达1000ｂｐ,但条件较难优化且费时。

(4)变性高效液相色谱(ＤＨＰＬＣ)变性高效液相色谱法(ＤＨＰＬＣ)是一项在ＳＳＣＰ和ＤＧＧＥ基础上发展起来的检测ＳＮＰ的突变技术,通过带正电荷的流动相将带负电荷的ＤＮＡ分子吸附到固定相上,基于同源双链和异源双链解链温度的不同,通过控制ＤＨＰＬＣ的温度,将系统维持在使异源双链发生变性的温度,而同源双链并未变性的情况下进行分离,样品在55℃左右的特殊吸附剂中,只需6ｍｉｎ即可完成50～700ｂｐ基因片段的分离。ＳＮＰ的有无最终表现为色谱峰的峰形和数目上,因为异源双链的解链温度较低,会先形成单螺旋ＤＮＡ从色谱柱中流出,在色谱图中会形成两个保留时间较短的色谱峰。

DHPLC无法象酶切检测对已知SNP实现100%检出,但它在寻找未知的SNP有明显的优势[1]，首先酶切无法寻找未知的碱基改变,而且并不是所有的碱基改变都能找到酶切位点。变性梯度凝胶电泳和单链构象多态性均耗时长、检出率低,测序的成本高,DHPLC检出一个样品仅需几分钟,且全自动化,因此可以采用DHPLC对大样本进行筛先,再对特异峰型者进行测序,这样可以降低成本、提高工作效率。

（5）基因芯片法：又称为DNA微探针阵列（Microarray）。它集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针，通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。这一技术已用于基因多态性的检测。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光探针杂交技术可以大大提高芯片的准确性、定量及检测范围。应用高密度基因芯片检测单核苷酸多态性，为分析SNPs提供了便捷的方法。(6)毛细管电泳(ＣＥ)采用20～100μｍ的细管代替琼脂糖和聚丙烯酰胺电泳,ＤＮＡ片段因离子表面积和分子外形的变异导致迁移时间不同而检测ＳＮＰｓ。

（7）实时荧光定量PCR：是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其应用主要包括：病毒感染定量监测、细胞因子表达分析、基因突变及其多态性。

在实时定量PCR中要使用荧光探针，其中有TAQman探针和分子灯塔（molecularbeaconMB)分子灯塔（molecularbeaconMB)又称为分子信标，由荧光能量传递技术和线性探针技术改进发展而来。国外于1996年开始应用研究，是目前最新的核酸检测技术。其优点有：特异性更高、操作进一步简化，检测更加快捷，而且减少了影响结果的不确定因素。不足：由于该技术目前还未完全成熟在探针设计、合成、标记等方面技术要求高，检测成本较高。四、几类基因的多态性与环境疾病易感性关系研究的现状

1应激蛋白及其基因多态性与疾病易感性的关系从原核生物的细菌到真核生物的人类,当接触高温或其他应激因素时,可以合成一组被称为热休克蛋白(heatshockproteins,HSPs)的蛋白质。其最重要的功能是帮助细胞适应一系列应激反应,而且导致HSPs表达或表达亚型上的改变,将会对应激因素产生不同的耐受性。因此,HSPs的多态性与疾病或机体遭受应激的易感性或耐受性有关[2]。热休克蛋白属于多基因家族，以人类HSP70基因家族基因为例：最先被克隆和鉴定的基因是HSP70-1、HSP70-2和HSP70-Hom除了以上三个基因，目前对HSP70家族其他基因研究的不多。HSP70家族成员均可以作为分子伴侣,促进新合成蛋白质的正确折叠、装配和转运,促进变性或损伤蛋白质的再折叠或降解等,参与机体的免疫功能。目前研究得最多的与HSP70多态性有关的疾病是一些与自身免疫紊乱有关的疾病，如：HSP70-2基因多态性被看作是系统性红斑狼疮（SLE）的一个新的易感性标记物。

Mestiri等的研究表明HSP70-2基因的变异不仅是乳腺癌危险性增加的标记物,而且可能预示其临床结果的好坏[3]

Jalbout等的研究表明HSP70-2的基因型是土耳其鼻咽癌危险性增高的标记物[4]。

2癌基因、抑癌基因多态性与疾病易感性的关系

ras基因家族与人类肿瘤相关的特征性基因有三种，即H-ras,K-ras,N-ras它们分别定位于11、12、1号染色体前二者是大鼠肉瘤病毒的转化基因，后者是从人神经母细胞瘤中分离得到的。它们编码的蛋白质分子量为21KD,称为P21蛋白。在人类部分肿瘤中,只要3个ras基因中有一个基因发生点突变,就会引起突变位点上的基因发生改变,这些位点的突变使ras基因激活,导致P21蛋白的过度生成,持续不断地将信号传入细胞,造成细胞的转化或恶变[5]。突变ras癌基因的种类与某些肿瘤类型密切相关。如：与肺癌、结肠癌、胰腺癌的发生发展密切相关的是K-ras基因的激活，造血系统肿瘤多发现N-ras的突变，泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。因此研究ras基因突变对于了解肿瘤的发生、发展具有重大意义。ahrendt等[6]对106例肺腺癌患者进行K-ras基因突变研究,发现发生突变的29例患者全部是吸烟者,而未吸烟者肺癌中未检测到K-ras基因突变,因此认为肺腺癌患者中K-ras基因突变与吸烟有着密切联系。以ras基因作为分子标记物,以肺癌患者的痰液、胸液、纤支镜取材等材料作为检测对象,应用聚合酶链反应、聚合酶链反应限制性酶切片段长度多态性分析及直接测序法等检测手段,检测组织中K-ras基因突变热点12、13、61等密码子的突变情况,同时结合荧光纤支镜、高分辨CT、超声、正电子发射计算机断层扫描等检查手段,可以发现肺癌高危人群,对肺癌的癌前病变及早期肺癌作出诊断[7,8]。

3代谢酶基因多态性与疾病易感性的关系

目前研究较多的是细胞色素P450，人类P450基因已知有17个家族,其中有20个亚家族已在人类基因组中定位。参与人体代谢的主要为CYP1至CYP3家族以及CYP4家族部分成员的基因产物[9]。外源化学物通过呼吸道、消化道、皮肤等途径进入机体,在大多数情况下,先经由细胞色素P450酶催化的Ⅰ相反应活化后,由前致癌物转化为致癌物,与生物大分子发生加合,造成基因损伤,启动化学致癌过程。

研究发现CYP1A1,CYP1A2,CYP1B1,CYP2A6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1,CYP3A4,CYP3A5等基因存在多态性。P450家族中存在的基因多态性使不同基因型携带个体对特定的外源化合物代谢能力不同,由此造成个体在环境因素暴露引起的健康损害存在易感性的差异。国内有人研究了慢性锰中毒易感性与CYP2D6基因第2938位突变的联系(该突变使酶活性降低),认为野生型较突变型有更高的锰中毒易感性[10]。

叶酸代谢通路与DNA合成和甲基化有关MTHFRGenotypeCasesControlsAdjustedOR(95%CI)No%No%AllCasesC677T（AlaVal）CC(ref.)5529.46036.11.00CT9048.18048.21.24(0.77-2.01)TT4222.52615.71.87(1.00-3.48)GastricCardiaCancerCC(ref.)2226.86036.11.00CT3846.48048.21.29(0.69-2.44)TT2226.82615.72.47(1.14-5.32)ShenH.,

etal.

IntJCancer2001;95:332-6.IF=4.06叶酸代谢酶基因MTHFR多态性与中国人胃癌（贲门癌）遗传易感性4修复基因多态性与疾病易感性的关系在外来有害因素作用下会导致机体细胞内DNA出现碱基错配、插入、缺失等结构改变，而人体内的基因修复酶可通过不同机制帮助机体修复这些错误，保护人体健康，相反如果修复基因出现突变以致修复酶功能缺陷可与某些疾病的发生有关。如：

MED1是一种碱基切除修复酶，能够直接或间接地帮助细胞修复癌症对基因的损害。研究中发现：缺陷的Med1基因与非息肉型的结肠直肠肿瘤（最常见的遗传性结肠直肠癌）有关。因此对修复基因多态性进行研究有助于深入了解某些疾病的发生、发展机制并可采取有效措施如：对高危险人群进行筛选等对相关疾病进行预防。

2002年，刘汝清[11]等采用聚合酶链式反应(PCR)单链构象多态性(SSCP)DNA直接测序法对100例正常人和88例肿瘤患者外周血白细胞进行MGMT基因多态性研究。结果发现：MGMT基因第3、4、5外显子上存在着多态性,其中第3、4外显子的多态改变与肿瘤形成的关系较弱,而第5外显子的多态仅见于肿瘤患者,可能与肿瘤的形成有关。MGMT基因的多态性主要表现为同义突变和错义突变,而且多为单个碱基的变异。点突变所致的单一氨基酸替换,如果发生在关键区域,可显著改变蛋白质的结构和功能。弄清楚MGMT基因变异的特征是理解其多态现象意义的关键。五、目前基因多态性与疾病易感性关系研究中存在的问题及对策1

由于多种原因，目前的研究大多还只是泛泛地进行频率调查或是简单地了解单个基因多态性与疾病发生、预后、转归的联系。没有大量进行多个基因之间多态性与疾病易感性的综合分析研究。2研究的样本要足够大，具有充分的代表性。3对于多基因病，应根据疾病病理生理学改变，选择多个候选基因客观地从不同的侧面进行分析。

4

候选基因的选择要有明确的病理生理学基础：研究某种疾病基因多态性与其发病及的联系，所选择候选基因的基因产物在该病发病机制中所起的作用应该得到肯定。5

当病例调查从发生频率及功能研究上均能确定某一候选基因多态性与疾病的发生、发展有肯定的联系后，应进行“复核验证”。即根据初步研究中所得出的结论在“散发”病例的观察中进行验证。明确前面所得到的假设是否可靠。

6研究过程中遇到的实际问题有：Whichgenes&whichSNPsshouldwestartwith（从哪些基因哪些位点开始）?PolymorphismsofLow-penetrancegenes:Whyaretheresultsalwaysinconsistent?

（为何相关性研究结果总是不一致？）Howlargethesamplesizeisinmolecularepidemiologicalstudies(SNPs)?

（样本量多大合适？）Whichgeneshouldwestartwith?

Considerationofbiology-

Basedonthemechanismofthedisease(Biologicalplausibility,adefinitivescientifichypothesis)Susceptivegenese.g.BRCA1,MSH2Sensitivegenese.g.GSTM1,GSTT1XRCC1,XPDCyclinD1,P53

Inconsistenceofpreviousassociationstudies

of

SNPsLow-penetrancegenesSmallsamplesizePublicationbiasExcessivelyemphasizethestratifiedresults(withoutthemaineffect!)LimitationsofobservationalstudiesPublicationbiasTheselectionfromeditorTheabandonbyresearcherhimselfToomanysubgroupresultsLargeindependentstudywithprecisedesignMulti-centercollaborationHowbigshouldthesamplesizebe?HowmanygenesandhowmanySNPsinvolvedHowhighthefrequencyofpolymorphismsHowstrongtheassociationbetweenpolymorphismsandcancerInformationfromMeta-analysise.g.NAT2GSTM17Strategies(I)Precisestudydesign

(payattentiontoenvironmentalexposures)LargesamplesizeMulti-centercollaborationHigh-throughputtechnologyUnpublishedSNPswithfunctionalevaluationMulti-siteswithinonegeneMulti-genesinonepathway:thegene-geneinteractionThecombinedanalysisofgenesinvolvedinmulti-pathwayandmulti-phaseofthediseasedevelopmentStrategies(II)AnalysisofhaplotypeandhaplotypeblockAnalysisofgene-environmentinteractionAnalysisofgenotype-phenotypecorrelationStrategies(III)六、展望

Informationfromthehumangenomesequencewillincreasethroughourunderstandingofdiseasemechanisms,andguidethedevelopmentofnewdrugsandtherapeuticprocedures.BellJ.Nature2004,429:453-456EvansWE.Nature2004,429:464-468DifferencesinDNAsequencesthatalterthefunctionofproteinsthataretargetedbydrugscancontributesignificantlytovariationintheresponsesofindividuals.基因检测-危险度评价PERSONALMEDICINE:Studiesinpharmacogeneticsrevealedthattheresponsetoananti-leukemiadrugcanbeeithertherapeuticortoxic.Asimplebloodtestcannowdeterminetheappropriatedosingofthedrugforeachindividual.基因型-药物选择多通路基因多态性与晚期结直肠癌对

5-Fu化疗敏感性的关系Stoehlmacher

etal.

BritishJournalofCancer

2004多个基因多态性联合作用与5-Fu化疗敏感性的关系

Collins和McKusick预言：到2010年，基因预测将投入实际应用，那些希望了解遗传易感性信息的个体将会被告之其基因多态的情况，这样可以帮助他们采取某些措施来减少危险暴露，甚至进行药物预防，以及在一定的年龄阶段开始针对性的体检，从而达到降低疾病发生可能性和早期发现疾病的目的。人类基因组的研究成果在疾病预防中的应用

一级预防：深入理解基因-环境交互作用（环境基因组学），确定高危险人群，从宏观和微观两方面确定预防措施(疾病预测和危险度评价)

二级预防：发展新的筛检试验，通过对人群基因型和/或家族史的分层来早期预测和诊断疾病(疾病基因组学)

三级预防和临床治疗：药物基因组学，个性化治疗，增加药物的疗效和减少副作用Gene-EnvironmentInteractionspontaneous15%Gene-environmentinteraction78%puregenetic5%pureenvironment2%EnvironmentGenetic--++20%80%100%17%83%Schulte,1994结语基因多态性研究为我们探索疾病的发生、发展机制以及表型多样化产生的本质开辟了一个全新的领域。在今天人类基因结构和功能的研究成果日新月异的形势下，对多基因参与的一些常见病，通过候选基因来综合分析疾病的发病机制，从而有效预防疾病发生是未来预防医学研究中的一个重要方向，也是目前将人类基因结构性研究成果应用于预防医学的一个较现实的途径。REFRENCES[1]沈靖,王润田,徐希平.筛查未知ＳＮＰｓ的变性高效液相色谱(Ｄ