纳米生物材料的神经毒性及其作用机理

纳米生物材料的神经毒性及其作用机理阮迪云中国科学技术大学生命科学学院，合肥230027E-mail:Ruandy@直径小于100纳米的生物纳米材料，可以与周围环境发生特殊的物理化学上的交互作用而表现出可能的生物学毒性。纳米生物材料可能在细胞、亚细胞和蛋白质水平上影响正常的生理功能，一些纳米颗粒很容易随机体运动，沉积到某些器官当中，穿过细胞膜，进入到线粒体中，对机体造成损害。纳米大小的生物材料使它组成的原子或者分子可能表现出迥异的生物适应性。例如，吸入或者慢慢灌输周围环境的极细颗粒（<100纳米）能够诱发肺部炎症，产生氧化应激。纳米量子点是一种具有特殊光学电学特性的纳米生物材料，它具有（1）尺寸小，可观察单个大分子的动态变化;（2）时间长，可观察数十个小时;（3）可观察不同分子相互作用的特点，因此被广泛地应用于生物医学领域。如用于神经科学研究中的离体或在体的生物标记。研究表明，纳米生物量子点可以导致细胞死亡或凋亡，能使细胞产生更多的自由基，造成氧化损伤；干扰神经细胞内的钙稳态；影响细胞膜上电压门控钠通道电生理特性；损伤神经元突触传递特性和突触可塑性，从而导致神经细胞损伤。1．纳米量子点浓度依赖性的诱导海马神经元死亡对原代培养的海马神经元，我们分别用MTTassay和DAPI染色技术来检测不同浓度的量子点暴露24小时后的细胞存活率。结果表明，浓度为1.0nM的量子点暴露下的细胞存活率与对照组没有显著性差异，而浓度为10nM和20nM的量子点暴露则能显著降低了细胞的存活率，MTTassay染色分别为对照组的80.4±4.3%和71.2±4.4%；用DAPI染色方法，其细胞存活率分别只有80.2±4.8%和72.1±3.4%。由此表明量子点暴露能浓度依赖性的增加细胞的死亡率。纳米量子点对海马神经元细胞内钙稳态的影响我们实验发现，纳米量子点能浓度依赖性的长时程提高细胞内钙水平。浓度在10nM以上未经包被的CdSe量子点能升高胞内钙水平长达15分钟以上。若用胞外无钙的细胞外液和细胞内钙耗尽药物Thapsigargin预处理细胞时，均不能完全阻断量子点引起的内钙浓度升高。说明在量子点的作用下，细胞内钙的升高既有细胞外钙的流入，也有细胞内钙库的钙释放。我们进一步用膜通道阻断剂验证，发现细胞外钙的流入主要是通过N型钙通道和电压门控钠通道而流入胞内的。钙离子通过电压门控钠通道流入胞内的同时还有一部分钠离子，它们可以激活线粒体上的MNCX,使一部分钙离子从线粒体里交换出来，这一部分钙离子和细胞外流入的钙离子可以进一步激活内质网上的Ryanodine受体，使大量的钙离子从内质网里释放出来。这一过程可能就是熟知的钙诱导钙释放的过程。这些实验结果表明，纳米量子点的毒性作用可能通过干扰神经细胞内的钙稳态，来影响神经元的功能。因此，神经细胞内钙浓度的升高可能是纳米量子点的神经毒性的重要作用机制之一。3.纳米量子点对神经元突触传递和突触可塑性的影响突触是连接神经元与神经元及神经元与靶组织的重要结构，神经系统的功能与神经元之间的突触传递和突触可塑性密切相关，因此，研究纳米量子点的神经毒性必须要研究纳米量子点对神经元突触传递及突触可塑性的影响。我们在麻醉大鼠上，用在位场电位记录的方法，比较了两种不同类型的量子点（分别为未经包被的裸核CdSe量子点和包被良好的strep-CdSe/ZnS量子点）的急性暴露对海马DG区突触传递和突触可塑性的影响。结果发现，这两种量子点都能提高基本的突触传递功能，如能提高基线的fEPSP的斜率和PS的幅度，增强Input/Output功能，但同时却损伤了短时程和长时程的突触可塑性，如降低了双脉冲反应和长时程增强。这两种量子点在对突触传递和可塑性的影响并无显著性差异。结果提示，如果应用量子生物材料时，必须考虑它对神经突触传递的毒性问题。4.纳米量子点对电压门控钠通道的影响离子通道在神经信号的产生、维持及信息加工过程中，在细胞代谢中起着非常关键的作用，因此，纳米量子点的神经毒性必然包括它对离子通道的损伤。我们用单细胞膜片钳技术研究了量子点对钠通道电生理特性的影响。当用不同浓度的量子点孵育海马细胞24小时后，我们观察了钠通道的激活、失活、复活等特性的变化。结果表明，10nM以上未经包被的CdSe量子点能够使钠通道的激活曲线向去极化方向移动，但延长了钠通道的激活时程；同时它使钠通道的失活曲线向超极化的方向移动，并减慢了钠通道的复活，减少了可被利用的钠通道的数目。这些看似矛盾的结果提示了量子点毒性的复杂性。（1）量子点对钠通道激活特性的影响在钳制电位-80mV下，给与细胞阶跃脉冲从-70mV到+30mV,可以获得细胞在不同激活电压下的钠电流，可以得到相应的电流-电压（I-V）曲线。浓度为10nM和20nM的量子点能使I-V曲线向去极化方向移动，其最大峰电流时的电压分别为-30mV和-20mV。而对照组与1.0nM量子点暴露组的峰电位为-35mV。用电导对激活电压可以得到钠通道的激活曲线，浓度为10nM和20nM的量子点暴露能使激活曲线向去极化的方向移动，半数激活电压V1/2从对照组的-45.3±0.4mV变为10nM量子点组的-40.8±0.5mV和20nM量子点组的-37.8±0.7mV，而1nM量子点组的跟对照组没有变化。（2）量子点对钠通道失活特性的影响将膜电位钳制在一定的条件下并且达到足够长的时间后，钠通道处于关闭或失活状态的数量达到一个稳态，这时用固定的测试电压即可得到处于关闭状态的钠通道开放所引起的通道电流。将电流峰值对条件电位作图，并用Boltzmann方程拟合，可以得到通道的稳态失活曲线。结果表明，浓度为10nM和20nM的的量子点暴露可以使钠通道的稳态失活曲线向去极化方向偏移。对照组的半数失活电压V1/2为-58.7±1.4mV，而在10和20nM量子点组则显著地降低，分别为-63.4±1.7mV和-62.8±1.1mV。而1.0nM的量子点暴露组相对于对照组没有变化。（3）量子点对钠通道复活时间的影响为了研究钠通道在不同时间的复活，我们用不同时间间隔（2-100ms）的两个-30mV(30ms)的去极化电压刺激来激活钠通道，以第二个钠电流峰值与第一个钠电流的峰值的比值I2/I1来衡量钠通道在第一次激活后的复活程度与时间的关系。曲线可以用单指数方程拟合，用拟合的时