第十三章液相色谱法

第十三章液相色谱法第一页，共四十页，编辑于2023年，星期一第十三章液相色谱法一、概述二、柱色谱法三、薄层色谱法第二页，共四十页，编辑于2023年，星期一第一节概述一、色谱法的产生及发展二、色谱法的分类三、色谱法的基本原理四、色谱法的特点第三页，共四十页，编辑于2023年，星期一第一节概述一、色谱法的产生及发展1、色谱法的出现2、色谱法的发展3、色谱法的现状和未来第四页，共四十页，编辑于2023年，星期一第一节概述一、色谱法的产生及发展1903年Tswett（茨维特）研究植物叶子组成时发明了色谱法固定相：碳酸钙流动相：石油醚玻璃柱：色谱柱第五页，共四十页，编辑于2023年，星期一第一节概述一、色谱法的产生及发展1931年Kuhn等用氧化铝和碳酸钙分离了α-,β-,γ-胡萝卜素等60多种植物色素1941年Martin和Synge建立了液液分配色谱法并提出气相色谱的设想1952年Martin等发明了气液色谱法1952年Martin和Synge获得诺贝尔化学奖1941年Consden等发展了纸色谱。第六页，共四十页，编辑于2023年，星期一第一节概述一、色谱法的产生及发展1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（TLC）得以实际应用，而在1956年Stahl开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。1957年Golay开创了开管柱气相色谱法，习惯上称为毛细管柱气相色谱60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱（HPLC）。80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，但在90年代后未得到较广泛的应用。80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳（CZE），在90年代得到广泛的发展和应用。同时集HPLC和CZE优点的毛细管电色谱在90年代后期受到重视。第七页，共四十页，编辑于2023年，星期一第一节概述一、色谱法的产生及发展1956年VanDeemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论，1965年Giddings总结和扩展了前人的色谱理论，为色谱的发展奠定了理论基础。21世纪色谱科学在生命科学等前沿科学领域发挥不可代替的重要作用。第八页，共四十页，编辑于2023年，星期一第一节概述二、色谱法的分类一）按两相所处状态分类流动相固定相类型液相色谱液体固体液-固色谱液体液体液-液色谱气体固体气-固色谱气体液体气-液色谱气相色谱第九页，共四十页，编辑于2023年，星期一第一节概述二、色谱法的分类二）按操作的形式分平面色谱

纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱色谱

填充柱色谱毛细管柱色谱

第十页，共四十页，编辑于2023年，星期一第一节概述二、色谱法的分类三）按分离原理分分配色谱：利用分配系数的不同吸附色谱：利用物理吸附性能的差异离子交换色谱：利用离子交换原理空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同第十一页，共四十页，编辑于2023年，星期一第一节概述三、色谱法的基本原理指被分离组分在两相中的“分配”平衡过程以吸附色谱为例吸附→解吸→再吸附→再解吸→反复多次洗脱→被测组分分配系数不同→差速迁移→分离微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的先出来，吸附能力强的组分后第十二页，共四十页，编辑于2023年，星期一第一节概述四、色谱法的特点特点：“三高”、“一快”、“一广”高选择性——可将性质相似的组分分开高效能——反复多次利用组分性质的差异，产生很好分离效果高灵敏度——10-11～10-13g，适于痕量分析分析速度快——几～几十分钟完成分离一次可以测多种样品应用范围广——气体，液体、固体物质，化学衍生化再色谱分离、分析

第十三页，共四十页，编辑于2023年，星期一第二节柱色谱法一、液-固吸附柱色谱法二、液-液分配柱色谱法三、离子交换驻色谱法四、凝胶柱色谱法第十四页，共四十页，编辑于2023年，星期一一、液-固吸附柱色谱法一）吸附作用与吸附平衡二）吸附剂及其选择三）流动相的选择第十五页，共四十页，编辑于2023年，星期一一、液-固吸附柱色谱法一）吸附作用与吸附平衡各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附能力差异而实现分离。K值越大，越容易被吸附，流出色谱柱越慢K值受吸附剂的活性、组分的性质、流动相性质的影响第十六页，共四十页，编辑于2023年，星期一一、液-固吸附柱色谱法二）吸附剂及其选择1、吸附剂的种类及性状常用吸附剂为多孔、微粒状物质硅胶氧化铝聚酰胺第十七页，共四十页，编辑于2023年，星期一二）吸附剂及其选择硅胶结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心特性活性和含水量有关，含水量越高，活性越低，级别越高。物质极性越大，吸附能力越强，不易洗脱吸水→失活→105～110℃烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大→500℃烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力适合分离酸性或中性物质第十八页，共四十页，编辑于2023年，星期一一、液-固吸附柱色谱法二）吸附剂及其选择氧化铝碱性氧化铝pH9～10适于分析碱性、中性物质中性氧化铝pH＞7.5适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝pH4～5适于分析酸性、中性物质特性：活性也和含水量有关，同硅胶聚酰胺氢键作用氢键能力↑强，组分越后出柱适用于天然产物有效成分的分离上第十九页，共四十页，编辑于2023年，星期一一、液-固吸附柱色谱法二）吸附剂及其选择2、吸附剂活性测定用柱色谱或薄层色谱测定取六种染料①偶氮苯②对甲氧基偶氮苯③苏丹黄④苏丹红⑤对氨基偶氮苯⑥对羟基偶氮苯都配成0.04%的溶液，溶剂为石油醚：苯为4：1固定相：上述固定相流动相：同溶剂让六种染料通过色谱住，根据染料在色谱柱上的位置判断活性第二十页，共四十页，编辑于2023年，星期一一、液-固吸附柱色谱法三）流动相的选择1、流动相的极性流动相的极性↑，洗脱能力↑。根据“相似相容”原理，来选择流动相。极性大的选择极性大的流动相2、被分离组分的极性官能团的极性大小烷烃＜烯烃＜醚类＜硝基化合物＜酯类＜酮类＜醛类＜硫醇＜胺类＜醇类＜羧酸①不饱和烃中双键越多，极性越大②母体相同，官能团的极性越大或越多，极性越大③空间排列对极性也有影响，一般有分子内氢键，被吸附力减弱④同系物中分子量越大，极性越小第二十一页，共四十页，编辑于2023年，星期一一、液-固吸附柱色谱法三）流动相的选择3、吸附剂的选择分离极性小的组分，用吸附能力大的吸附剂分离极性大的组分，用吸附能力小的吸附剂三者关系图示：组分吸附剂流动相极性活性小极性非(弱)极性活性大非极性或弱极性第二十二页，共四十页，编辑于2023年，星期一二、液-液分配柱色谱法1、分离原理2、载体3、流动相与固定相第二十三页，共四十页，编辑于2023年，星期一二、液-液分配柱色谱法一）分离原理利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离连续萃取过程第二十四页，共四十页，编辑于2023年，星期一二、液-液分配柱色谱法一）分离原理正相色谱：流动相的极性比固定相弱反相色谱：流动相的极性比固定相强分配系数K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温有关第二十五页，共四十页，编辑于2023年，星期一二、液-液分配柱色谱法二）载体三）流动相与固定相要求：固定相→机械吸附在惰性载体上的液体流动相→必须与固定相不为互溶（所以洗脱剂必须与固定液饱和）载体→惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应第二十六页，共四十页，编辑于2023年，星期一三、离子交换柱色谱法一）原理二）离子交换树脂的分类三）离子交换平衡四）离子交换树脂的性能第二十七页，共四十页，编辑于2023年，星期一三、离子交换柱色谱法一）原理分离机制：依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同而实现分离交换能力弱的，迁移速度快固定相→离子交换树脂流动相→水为溶剂的缓冲溶液被分离组分→离子型的有机物或无机物第二十八页，共四十页，编辑于2023年，星期一三、离子交换柱色谱法二）离子交换树脂的类型离子交换树脂是一类具有网状结构的高分子聚合物。性质稳定，与酸、碱、某些有机试剂不反应。常用的是聚苯乙烯型的，以苯乙烯为单体、二乙烯苯为交联剂阳离子型：在树脂骨架上引入酸性基团，如磺酸基（-SO3H）、羧基（-COOH）、酚羟基（-OH）

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

阴离子型：在树脂骨架上引入碱性基团，如季铵基（-N（CH3）3+OH-）、伯胺基（-NH2.H2O）

RN（CH3）3+OH-+X-

＝RN（CH3）3+X-+OH-第二十九页，共四十页，编辑于2023年，星期一三、离子交换柱色谱法三）离子交换平衡离子交换反应用下列通式表示

R-B++A+=R-A++B+

R代表固定相，W代表流动相相KA/B↑，对A离子结合牢固，B离子在前，A离子在后。与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质第三十页，共四十页，编辑于2023年，星期一三、离子交换柱色谱法四）离子交换树脂的性能1、交联度指离子交换树脂中交联剂的含量。交联度↑，网状结构紧密，选择性好，速度慢阳离子交换树脂交联度为8%，阴离子为4%2、交换容量在实验条件下，每克干树脂真正参加交换的基团数，可用酸碱滴定法测定。单位为mmol/g一般为1～10mmol/g第三十一页，共四十页，编辑于2023年，星期一四、凝胶柱色谱法原理利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离固定相→多孔性凝胶流动相→水——凝胶过滤色谱流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱第三十二页，共四十页，编辑于2023年，星期一四、凝胶柱色谱法渗透平衡Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小与流动相的性质无关第三十三页，共四十页，编辑于2023年，星期一

总结四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和渗透系数除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响第三十四页，共四十页，编辑于2023年，星期一第三节薄层色谱法（一）概述（二）定性参数（三）吸附剂的选择（四）展开剂的选择（五）薄层板的制备（六）定性与定量分析第三十五页，共四十页，编辑于2023年，星期一第三节薄层色谱法一、概述1、定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法2、操作过程铺板→活化→点样→展开→定位(定性)/洗脱(定量)3、分离机制：吸附、分配，离子交换，空间排阻4、特点：分析快速、灵敏、显色方便5、应用：药物杂质检查、纯度测定

第三十六页，共四十页，编辑于2023年，星期一第三节薄层色谱法二、定性参数1、比