第二章目的基因获得演示文稿

第二章目的基因获得演示文稿当前第1页\共有102页\编于星期五\22点三、目的基因的获得限制酶酶切直接分离法PCR扩增法从mRNA合成cDNA化学合成法通过构建基因文库分离法当前第2页\共有102页\编于星期五\22点对已克隆在载体中的目的基因，可根据目的基因两侧的限制酶识别序列，选择适当的限制酶酶切，获得目的基因。（一）限制酶酶切直接分离法注意：目的基因内部不能有该限制酶的切点，否则目的基因会被切成碎片！当前第3页\共有102页\编于星期五\22点Ampr5’AOX1HIS4Kanr3’AOX1ColE1pPIC9K/hVEGF165EcoRINotIBglIIhVEGF165BglII9.8KbTTSAmpr5’AOX1HIS4Kanr3’AOX1ColE1

pPIC9K9.3KbBglIIBglIISnaBIEcoRIAvrIINotISTTf1oriAmprlacZpGEM-T/hVEGF165hVEGF1653.5Kb当前第4页\共有102页\编于星期五\22点

（二）PCR法扩增目的基因利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。PCR(polymerasechainreaction)：当前第5页\共有102页\编于星期五\22点以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。双链DNA解链为单链DNA；引物与模板单链DNA的特定互补部位配对、结合；退火：变性：延伸：变性退火延伸当前第6页\共有102页\编于星期五\22点30thcycle？由于每一循环所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增加，即Y=2n(n为循环次数)。230(109)copies当前第7页\共有102页\编于星期五\22点PCR技术的发明--DNA操作技术的革命发明人：美国生化学家KaryB.MullisTheNobelPrizeinChemistry1993MullisKB.Theunusualoriginofthepolymerasechainreaction.ScientificAmerican.1990,262(4):56-61,64-5.1990.04MullisKB.Dancingnakedinthemindfields.1998.04当前第8页\共有102页\编于星期五\22点1983.03开汽车时的联想：蜿蜒崎岖的山路--DNA双螺旋行驶的汽车--一小段DNA引物1972在加州大学伯克利分校获得博士学位1979进入私人生物技术公司Cetus

1983.08正式做有关PCR原理的报告1983.09Mullis开始动手做实验1984.11首次取得可信结果1985.01

RandallSaiki加入，结果毋庸置疑当前第9页\共有102页\编于星期五\22点1985.03Cetus公司申请专利1985.12SaikiRK,ScharfSJ,FaloonaFA,MullisKB,HornGT,ErlichHA,ArnheimN.Enzymaticamplificationofbeta-globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysisfordiagnosisofsicklecellanemia.Science.1985,230(4732):1350-4.1986.05冷泉港“人类分子生物学”专题研讨会1987.01MullisKB,FaloonaFA.SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerasecatalyzedchainreaction.MethodsinEnzymology.1987,155:335-50.当前第10页\共有102页\编于星期五\22点1991.12Cetus以$3亿将专利卖给Hoffmann-LaRoche公司1986.06Saiki等将耐热DNA聚合酶--Taq酶引入PCR技术。SaikiRK,GelfandDH,StoffelS,ScharfSJ,HiguchiR,HornGT,MullisKB,ErlichHA.Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science.1988,239(4839):487-91.1988.011989Science杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。1986.09Mullis离开Cetus公司当前第11页\共有102页\编于星期五\22点EppendorfBio-radABI当前第12页\共有102页\编于星期五\22点PCR法扩增目的基因的前提：已知目的基因全序列或其两侧序列，化学合成与模板互补的上、下游引物。

当前第13页\共有102页\编于星期五\22点

Taq酶无3’→5’外切酶活性，无阅读校正功能，在扩增过程中会引起错配，30次循环Taq酶错配率约0.25％。措施：问题：可能造成目的基因碱基序列的改变。原因：选择高保真Taq酶，如Pfu。当前第14页\共有102页\编于星期五\22点因Taq酶对dATP具有优先聚合活性。5’AAPCR扩增产物5’由Taq酶扩增的PCR产物，3’末端总是带有一个非模板依赖型的突出碱基，而这个碱基几乎总是A，T载体TT5’5’T7lacZMCSoriAmpr可用T载体克隆。

当前第15页\共有102页\编于星期五\22点

（三）从mRNA合成cDNA以目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA第一链，然后在Klenow酶作用下合成双链cDNA。当前第16页\共有102页\编于星期五\22点此法适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白mRNA的比例占总mRNA的90%以上。当前第17页\共有102页\编于星期五\22点目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下。目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%。高丰度mRNA：低丰度mRNA：当前第18页\共有102页\编于星期五\22点步骤：dNTP逆转录酶primer逆转录酶催化合成cDNA第一链mRNAcDNA钓取目的基因的mRNAmRNA逆转录酶逆转录酶去除mRNA-cDNA杂交链中的mRNA链cDNAKlenow酶dNTPKlenow酶合成cDNA第二链cDNAcDNA当前第19页\共有102页\编于星期五\22点钓取目的基因的mRNA：与oligo(dT)碱基互补的mRNA结合到柱上，非mRNA(tRNA、rRNA）流走。总mRNAoligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纤维素柱oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纤维素柱总RNA1）提取特定组织或细胞的总RNA，用oligo(dT)纤维素柱分离总mRNA。当前第20页\共有102页\编于星期五\22点2）根据已知基因序列合成DNA探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化特定mRNA。与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特定mRNA探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA纤维素柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA纤维素柱总mRNA当前第21页\共有102页\编于星期五\22点克隆平端双链cDNA的方法：平端直接与载体连接；平端接同聚尾；加装人工接头(adapter)；加装衔接物(linker)。当前第22页\共有102页\编于星期五\22点加装同聚物尾：利用TdT，在双链cDNA和载体3’端加互补的同聚物尾，退火连接成重组分子。1972年，斯坦福大学P.Labban和P.Kaiser发明。CCCCCCCCCCCCdCTPTdTcDNA5’3’载体5’3’GGGGGGGGGGGGdGTPTdTCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGT4DNAligase当前第23页\共有102页\编于星期五\22点加装人工接头(adapter)1978年，康奈尔大学吴瑞发明。adapter是人工合成的一头具有某种限制酶的粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。GTCGCAGCTTAA5’3’EcoRIadapter当前第24页\共有102页\编于星期五\22点注意：adapter易通过粘端碱基配对形成二聚体。GTCGCAGCTTAA5’3’AATTCGACGCTG3’5’AATTCGACGCTGGTCGCAGCTTAA5’3’3’5’T4DNAligase将adapter连接到双链cDNA的两端，直接成为人工粘端。当前第25页\共有102页\编于星期五\22点CIP去除adapter的5’-P，使5’-P成为5’-OH。5’P-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-P5’3’3’CIP5’OH-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-OH5’3’3’措施：当前第26页\共有102页\编于星期五\22点加装衔接物(linker):

linker是人工合成的一段由10-12个核苷酸组成、具有一个或多个限制酶识别序列的平末端双链寡核苷酸短片段。EcoRIlinker5’TGGAATTCCAACCTTAAGGT5’3’3’当前第27页\共有102页\编于星期五\22点将双链cDNA与linker连接，再用限制酶酶切，可产生粘性末端。当前第28页\共有102页\编于星期五\22点

（四）化学合成法1979年，成功合成E.coli酪氨酸tRNA基因。

Science1976年，H.G.Khorana提出用化学方法合成基因的设想；当前第29页\共有102页\编于星期五\22点已知目的基因的DNA序列。化学合成法的前提：当前第30页\共有102页\编于星期五\22点小片段粘接法补钉延长法大片段酶促法战略：化学合成的DNA片断一般局限在200bp以内。当前第31页\共有102页\编于星期五\22点1）小片段粘接法：分别合成12-15bp的单链DNA小片段。混合退火T4DNAligase片断之间有互补区，混合退火形成有断点的双链，再由T4DNAligase连接成完整双链。当前第32页\共有102页\编于星期五\22点2）补钉延长法：混合退火片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整双链。T4DNA

ligaseKlenow分别合成12-15bp的单链DNA小片段及20-30bp的单链DNA中片段。当前第33页\共有102页\编于星期五\22点3）大片段酶促法：分别合成40-50bp的单链DNA大片段。混合退火T4DNA

ligaseKlenow片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整双链。当前第34页\共有102页\编于星期五\22点化学合成的份额较大，成本较高。大片段化学合成的收率极低，如合成50bp的DNA单链大片段的总收率仅7.7%。三种方法各有利弊：小片段粘接法：大片段酶促法：化学合成DNA的单链片段愈短，收率愈高；化学合成的份额较小，成本较低；当前第35页\共有102页\编于星期五\22点化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。当前第36页\共有102页\编于星期五\22点DNA合成仪是根据固相亚磷酰胺三酯法原理设计的。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酰胺三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。当前第37页\共有102页\编于星期五\22点DNA合成仪基因合成一般都是自己设计序列，交给商业公司合成。当前第38页\共有102页\编于星期五\22点DNA化学合成的用途：合成天然基因修饰改造基因设计新型基因合成测序或PCR引物制备寡核苷酸探针制备人工接头(adaptor)和衔接物(linker)当前第39页\共有102页\编于星期五\22点合成天然基因：有些组织特异性mRNA含量很低，很难用cDNA法克隆。有些基因比较短，化学合成费用较低。

如：生长激素释放抑制激素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等。当前第40页\共有102页\编于星期五\22点合成寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe)：根据已知核酸序列，用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，作为探针使用。若未知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸序列倒推出核酸序列，但需考虑密码子的简并性。当前第41页\共有102页\编于星期五\22点大多数氨基酸拥有简并密码子。某段连续的氨基酸序列:CysMetAspGluMetLys可能的DNA序列:TGTATGGACGAAATGAAACTGG设计系列探针:TGTATGGACGAAATGAAATGTATGGACGAGATGAAATGTATGGATGAAATGAAATGTATGGATGAGATGAAATGTATGGACGAAATGAAGTGTATGGACGAGATGAAGTGTATGGATGAAATGAAGTGTATGGATGAGATGAAGTGCATGGACGAAATGAAATGCATGGACGAGATGAAATGCATGGATGAAATGAAATGCATGGATGAGATGAAATGCATGGACGAAATGAAGTGCATGGACGAGATGAAGTGCATGGATGAAATGAAGTGCATGGATGAGATGAAG当前第42页\共有102页\编于星期五\22点（五）通过构建基因文库分离目的基因基因库(genepool)基因文库(genelibraryorgenebank)

基本概念:当前第43页\共有102页\编于星期五\22点是特定生物体全基因组的集合（天然存在）。基因库：

当前第44页\共有102页\编于星期五\22点是从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆形式存在（人工构建）。基因文库：当前第45页\共有102页\编于星期五\22点根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库(genomicDNAlibrary)

cDNA文库(cDNAlibrary)

当前第46页\共有102页\编于星期五\22点基因组文库：cDNA文库：含全部基因。含全部蛋白质编码的结构基因。鸟枪法构建；材料来自染色体DNA；cDNA法构建；材料来自mRNA；当前第47页\共有102页\编于星期五\22点1、基因组文库将某种生物基因组DNA经超声波或限制酶部分酶切处理后，与载体连接，转化宿主细胞，得到含全部基因的克隆群体。当前第48页\共有102页\编于星期五\22点1、基因组DNA的制备：制备的DNA分子量越大，切割后含不规则末端DNA片段的比率越低，重组率和完备性越高。基因组文库的构建为最大限度保证基因的完整性，基因组DNA在分离纯化操作中应避免过度断裂。

当前第49页\共有102页\编于星期五\22点常规方法制备的染色体DNA长度一般100kb，如先将细胞固定在低熔点琼脂糖凝胶，再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1,000kb的DNA片段。当前第50页\共有102页\编于星期五\22点一般采用超声波和限制酶部分酶切法。保证DNA片段大小均一。2、基因组DNA的切割：目的：保证DNA片段之间存在部分重叠区；当前第51页\共有102页\编于星期五\22点超声波处理：处理后的DNA片段呈平末端，需加装人工接头。当前第52页\共有102页\编于星期五\22点产生粘性末端，可与常用克隆位点（如BamHI、BglII）连接。部分酶切法：部分酶切片段大小可控，可得到15-45kb的随机片断；选用4bp识别序列的限制酶，如Sau3A。当前第53页\共有102页\编于星期五\22点3、载体和受体的选择构建大型基因组文库（动植物和人类），选择BAC或YAC。根据载体，选择E.coli、Yeast。常选-DNA或Cosmid；受体：载体：当前第54页\共有102页\编于星期五\22点当前第55页\共有102页\编于星期五\22点当前第56页\共有102页\编于星期五\22点在基因组文库构建中，最应引起重视的问题：尽量提高载体与外源DNA片段的连接效率！根据载体的装载量，将DNA片段分级分离；利用CIP，去除载体的5’-P；利用TdT，在DNA片段的3’-OH加同聚尾。措施：当前第57页\共有102页\编于星期五\22点基因文库的完备性：是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率P，与基因文库最低所含克隆数N的关系：N=ln(1–P)/ln(1–f)P=基因文库的完备性（某一基因被克隆的概率）f=克隆片段平均大小/生物基因组大小当前第58页\共有102页\编于星期五\22点N=ln(1–P)/ln(1–f)如：人单倍体DNA长2.9×106kb，克隆片段平均大小15kb，构建完备性0.9的基因文库，至少需45万个克隆；当完备性提高至0.9999时，至少需180万个克隆。即：为保证某一基因以99.99%的机率至少被克隆1次，需构建含180万个不同重组克隆的基因文库，这时克隆片段总和为整个基因组的

倍。9.3当前第59页\共有102页\编于星期五\22点即：为保证某一基因以99.99%的机率至少被克隆1次，需构建含180万个不同重组克隆的基因文库，若1个基因文库的插入片段总和为整个基因组的10倍以上，就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。当前第60页\共有102页\编于星期五\22点基因文库的质量标准：除尽可能高的完备性外，理想的基因文库还应具备：重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。克隆总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；载体的装载量必须大于基因的长度；含有相邻DNA片段的重组克隆之间，需存在足够长度的重叠区，以利于克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；当前第61页\共有102页\编于星期五\22点基因组文库的保存影印滤膜保存法保存文库于液体培养基中保存单个克隆子于液体培养基中当前第62页\共有102页\编于星期五\22点1）影印滤膜保存法：当前第63页\共有102页\编于星期五\22点2）保存文库于液体培养基中从平板上挑取全部克隆，接种于含适当抗生素的液体培养基中，混合的细菌生长数代后，加入终浓度25%的甘油，-70℃保存。缺点：由于文库菌落生长的不均匀性，可能导致文库中某些特定序列过多或过少。当前第64页\共有102页\编于星期五\22点3）保存单个克隆子于液体培养基中从平板上挑选单个克隆，接种于含适当抗生素的液体培养基中，菌体生长至一定浓度时，加入终浓度25%的甘油，-70℃保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。当前第65页\共有102页\编于星期五\22点从基因组文库中筛选目的基因大型基因组文库由数十万甚至上百万个重组克隆组成，除一些具特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因）可用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选）直接筛选外，一般均需多轮操作步骤。当前第66页\共有102页\编于星期五\22点密集铺板（1-10万）杂交挖取铺板目的重组克隆铺板根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选当前第67页\共有102页\编于星期五\22点通过构建基因组文库获取目的基因的问题：该方法仅适用于原核基因的分离，较少采用。不能除去真核生物目的基因的内含子结构。工作量大，需了解目的基因的背景知识；不能获得最小长度的目的基因；当前第68页\共有102页\编于星期五\22点“鸟枪法(shotgun)”：又称“散弹法”用限制酶部分酶切染色体DNA将酶切片段克隆入载体转化受体细胞并扩增分离带有目的基因的DNA片段筛选目的重组子当前第69页\共有102页\编于星期五\22点用“鸟枪法”获取目的基因：缺点：操作简便。工作量大；具有一定的盲目性。优点：当前第70页\共有102页\编于星期五\22点优点：保证目的基因的完整性，提高目的重组子的出现频率，简化操作。鸟枪法操作的改进：

使用特定限制酶完全酶切染色体DNA。前提：已知目的基因的酶切图谱。策略：用目的基因两端的限制酶完全酶切染色体DNA，然后与载体拼接。当前第71页\共有102页\编于星期五\22点2.0kb1.6kb1.8kb如：已知目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，切下区域内的凝胶块，从此凝胶中回收DNA片段，与载体连接。当前第72页\共有102页\编于星期五\22点基因组文库重组克隆的排序构建大型基因组文库技术上并不困难，若文库插入片段总和为基因组的10倍以上，就能从其中调出任何一段DNA序列。

然而基因文库的克隆是随机序列，必须将所有克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。

这项工作的工作量远大于文库构建。当前第73页\共有102页\编于星期五\22点酶切片段末端标记法随机探针联合杂交法染色体走读法基因组文库重组克隆的排序方法：当前第74页\共有102页\编于星期五\22点酶切片段末端标记法：1、将单一YAC克隆插入DNA片段用限制酶均匀地水解成若干片段，末端标记同位素。HHHH载体DNA克隆DNA当前第75页\共有102页\编于星期五\22点2、然后用Sau3A将末端标记的DNA片段降解成碎片，PAGE电泳，每10个YAC克隆走在一块板上，形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱。SSSSSSSSSSSSSSSSSSS10克隆指纹图谱12345678910当前第76页\共有102页\编于星期五\22点3、电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同，二者就有互相重叠的可能性，在染色体上则可能是排列一起的。10克隆指纹图谱12345678910当前第77页\共有102页\编于星期五\22点随机探针联合杂交法：1、将若干YAC克隆固定在薄膜上，复制20份薄膜；合成20种不同序列的短探针（序列随机）。0102030405060708091011121314151617181920ABCDEFG当前第78页\共有102页\编于星期五\22点2、用20种探针随机定位杂交（1对1）20份YAC克隆薄膜。若某2个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这2个克隆有可能相互重叠。0102030405060708091011121314151617181920ABCDEFG20个随机探针当前第79页\共有102页\编于星期五\22点3、若将杂交阳性结果记为“1”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC克隆的排列顺序。0102030405060708091011121314151617181920DABCEFG111111111111111111111111111111当前第80页\共有102页\编于星期五\22点0104120613140214071911150508160310092018DABCEFG111111111111111111111111111111FCADGEB当前第81页\共有102页\编于星期五\22点1、从基因文库中任取1个克隆作为染色体走读的起点，将其两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5-2.0kb范围内。染色体走读法(chromosomewalking)：走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列当前第82页\共有102页\编于星期五\22点2、以亚克隆DNA片段为探针，与基因文库杂交，阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起。

走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列探针标记第一轮杂交阳性克隆阳性克隆当前第83页\共有102页\编于星期五\22点3、再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体DNA的端点。阳性克隆阳性克隆第二轮杂交第二轮杂交当前第84页\共有102页\编于星期五\22点走读的起点克隆片段当前第85页\共有102页\编于星期五\22点将某种生物基因组转录的全部mRNA通过反转录合成cDNA，与载体连接，转化宿主细胞，得到含全部表达基因的克隆群体。

2、cDNA文库当前第86页\共有102页\编于星期五\22点信息量远小于基因组文库，容易构建；具有时空性和组织细胞特异性。cDNA文库的特点：不含内含子序列；可以在细菌中直接表达；包含该生物全部蛋白质编码的结构基因；当前第87页\共有102页\编于星期五\22点在高度分化的生物体中，不同组织或细胞在相同时段、相同环境背景下，mRNA种类、表达水平也不同。同一组织或细胞在不同时段、不同环境背景下，mRNA种类、表达水平不同。具有时空性和组织细胞特异性：当前第88页\共有102页\编于星期五\22点cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此具有时空性和组织细胞特异性。当前第89页\共有102页\编于星期五\22点cDNA文库的构建总RNA提取mRNA的分离纯化cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成当前第90页\共有102页\编于星期五\22点1）总RNA提取：商业化试剂盒。当前第91页\共有102页\编于星期五\22点利用mRNA含polyA尾，将其从总RNA中分离纯化，mRNA只占总RNA的1-2%。2）mRNA的分离纯化：商业化oligo(dT)纤维素柱。哺乳动物mRNA长度为，大部分为。当前第92页\共有102页\编于星期五\22点当前第93页\共有102页\编于星期五\22点3）cDNA第一链的合成：cDNA第一链mRNAAAAAAAAAAAAAAA3’AAAAAAAAAAAAAA