第十一章维生素的测定

第十一章维生素的测定第一页，共三十四页，编辑于2023年，星期一脂溶性微生物素（如A、D、E、K等）；水溶性维生素（如B1、B2、B6、C、B12等）。维生素A：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜炎、夜盲症等疾病。维生素B1：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经炎，帮助消化，促进发育。维生素B2：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。维生素C：防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力。维生素D：调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的代谢，并能防止软骨病。

目前已发现的维生素约有二、三十种，按维生素溶解性能可将它们分成两大类：第二页，共三十四页，编辑于2023年，星期一

分析方法维生素的分析方法可分为以下几种：（1）涉及人体和动物的生物分析方法。（2）利用原生动物、细菌和酵母的微生物分析方法（3）分光光度法、荧光法、色谱、酶法和免疫等物理化学分析方法。第三页，共三十四页，编辑于2023年，星期一

脂溶性维生素的测定一、维生素A目前维生素A都是合成的，来源：（1）从动物肝脏中得到；（2）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡萝卜素，主要是β-胡萝卜素）维生素A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。对于三氯化锑比色法适用于样品中含VA高的样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维生素A含量低的样品，如每克样品中含5～10μg维生素A时，这时样品由于受其脂溶性物质的干扰，不应用比色法测定。对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，可直接测定维生素A的含量，对样品中含VA低的也可以测出可信结果，操作简便、快速。第四页，共三十四页，编辑于2023年，星期一

1、维生素A的性质

⑴因有许多不饱和链，故见光易分解；⑵在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时间短，因为时间长，见光时间长，见光分解，故测出的比出厂的含量要少；⑶对碱稳定；第五页，共三十四页，编辑于2023年，星期一2.测定方法2.1三氯化锑光度法2.1.1测定原理在氯仿溶液中，维生素A与三氯化锑作用可生成蓝色可溶性络合物，在620nm波长处有最大吸收峰，其蓝色的深浅与维生素A的含量在一定范围内成正比，故可通过吸光度测定维生素A的含量。

第六页，共三十四页，编辑于2023年，星期一2.1.2测定步骤

⑴样品用有机溶剂萃取脂类样品可以根据脂肪的测定处理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用回流方法提取脂类。如果样品中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。⑵脂类的皂化脂类含有维生素和脂肪这两部分，通过皂化（50%KOH、无水C2H5OH、热回流）把它们分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。皂化条件：（1）C2H5OH︰脂类=8︰1；（2）皂化温度与时间：70℃、30分钟在皂化时可以加入抗氧剂焦性没食子酸，防止氧化。第七页，共三十四页，编辑于2023年，星期一目前皂化有三种情况：低碱=脂肪︰KOH为1︰2.5的关系另外在皂化时加抗氧化剂与不加抗氧化剂回收率不一样，加抗氧化剂的回收率高于不加抗氧化剂的回收率。

低温（室温）中温（70℃±2℃）高温（100℃15min）低碱低碱低碱回收率不完全回收率46%回收率70%第八页，共三十四页，编辑于2023年，星期一⑶提取：不皂化物和皂化物经水、乙醚萃取可得到不皂化物。⑷柱层析分离干扰物质采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把β-胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素A与β-胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离开。如果样品中只有维生素A而不含β-胡萝卜素时，这时可直接定容。维生素A与β-胡萝卜素分离：吸附剂：

8份中性Al2O3和2份碱性Al2O3混合，装柱分离方法：a.用2%丙酮石油醚洗β-胡萝卜素；

b.用乙醚洗VA。第九页，共三十四页，编辑于2023年，星期一2.1.3计算SbCl3比色法维生素A／CHCl3＋SbCl3／CHCl3→形成兰色物质→在620nm有最大吸光峰这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。计算：每百克样品含VA的量=C×（V1/V2）×（100/W）C：从标准曲线上查得VA的量V1：CHCl3定容的量V2：测定所取样液体积第十页，共三十四页，编辑于2023年，星期一说明及讨论（1）乙醚中是否含有过氧化物的检验方法（2）乙醇中是否含有醛的检验方法（3）三氯甲烷中是否含有分解产物2CHCl3+O22HCl+2CCl2O（4）所用氯仿不应含有水SbCl3+H2OSbOCl+2HCl（4）维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行（5）由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。（6）三氯化锑腐蚀性较强，不能沾在皮肤上，用过的仪器应用盐酸浸泡而后清洗。（7）本法适用于维生素A含量较高的样品。第十一页，共三十四页，编辑于2023年，星期一紫外吸收光谱：分子价电子能级跃迁。波长范围：100-800nm.(1)远紫外光区:

100-200nm(2)近紫外光区:200-400nm(3)可见光区:400-800nm250300350400nm1234eλ可用于结构鉴定和定量分析。电子跃迁的同时，伴随着振动转动能级的跃迁;带状光谱。2测定方法

2.2紫外分光光度法

紫外吸收光谱的产生

第十二页，共三十四页，编辑于2023年，星期一Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系假设一束平行单色光通过一个吸光物体第十三页，共三十四页，编辑于2023年，星期一

紫外分光光度法测定维生素A

原理：VA为脂溶性的，测定VA时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部分，在经柱层析除去杂质等干扰物质，在紫外328nm下测定，求出含量。第十四页，共三十四页，编辑于2023年，星期一二、维生素D

1.维生素D的性质维生素D是类固醇的衍生物，具有维生素D活性的物质约10余种，在功能上可以防治佝偻病。其中最主要的是维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙醇)。

维生素D在鱼肝油和鸡蛋黄等食品中含量较多，一般成人不会缺VD，而婴儿容易缺乏。第十五页，共三十四页，编辑于2023年，星期一2.测定方法2.1三氯化锑光度法原理：在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，并于500nm波长处有一个最大吸收，其呈色程度与维生素D含量成正比。

维生素D／CHCl3

＋SbCl3／CHCl3→形成橙黄色物质→500nm下测定

第十六页，共三十四页，编辑于2023年，星期一说明食品中维生素D含量一般较低，而其他维生素及物质含量大于维生素D，对测定产生干扰，测定前必须经柱层析除去这些物质。此法测定值为D2和D3的总量。第十七页，共三十四页，编辑于2023年，星期一2.2紫外分光光度法

VD／乙醇→265nm下测定

2.3高效液相色谱法（HPLC）基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性第十八页，共三十四页，编辑于2023年，星期一水溶性维生素的测定一、维生素B1的测定VB1又叫硫胺素1、食品中VB1的存在形式⑴常以游离态存在；⑵复合脂形式存在（磷蛋白）；⑶辅羧酶形式存在

VB1在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，动物组织不如植物含量丰富。第十九页，共三十四页，编辑于2023年，星期一2、VB1的性质⑴VB1在中性、碱性下不稳定，易分解；⑵VB1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；⑶VB1为白色结晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。

3、VB1的测定

世界各国都用荧光法测定第二十页，共三十四页，编辑于2023年，星期一一、荧光与磷光的产生过程

1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…

；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…

；第二十一页，共三十四页，编辑于2023年，星期一S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫第二十二页，共三十四页，编辑于2023年，星期一二、激发光谱与荧光(磷光)光谱

excitationspectrumandfluore-scencespectrum1.荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；第二十三页，共三十四页，编辑于2023年，星期一2.荧光光谱(或磷光光谱)

固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。第二十四页，共三十四页，编辑于2023年，星期一第二十五页，共三十四页，编辑于2023年，星期一三、荧光的产生与分子结构的关系

1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：第二十六页，共三十四页，编辑于2023年，星期一2.定量依据与方法(1)定量依据

荧光强度

If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：

If=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)浓度很低时，将括号项近似处理后：

If

=2.3I0lc

=Kc第二十七页，共三十四页，编辑于2023年，星期一（2）定量方法标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度第二十八页，共三十四页，编辑于2023年，星期一VB1的测定原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成一种兰色荧光物质，即为硫色素，在紫外光下，硫色素发出荧光。第二十九页，共三十四页，编辑于2023年，星期一二、维生素B2的测定（1）VB2的特性（PropertiesofVB2）①对热稳定，对酸和中性pH也稳定,在120℃加热6h仅少量破坏。②在碱性条件下迅速分解。③在光照下转变为光黄素和光色素,并产生自由基,破坏其它营养成分产生异味,如牛奶的日光臭味即由此产生。第三十页，共三十四页，编辑于2023年，星期一第三十一页，共三十四页，编辑于2023年，星期一三、维生素C的测定

维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。根据它具有的还原性质可以