生物微量元素研究生物利用性与生物强化

生物微量元素研究—生物利用性与生物强化

BioavailabilityandBiofortificationofTraceElements(TEs)学术沙龙报告之三主讲：胡广林（应化系）2012-11-291当前第1页\共有74页\编于星期四\19点TopicstoCoverIntroductiontoBiologicalTraceElements12ModelstoEvaluateTraceElementsBioavailability3BiofortificationofTraceElements2当前第2页\共有74页\编于星期四\19点TraceElements

Definitions

MacroelementsVS.MicroelementsMacronutrientsVS.Micronutrients

AbsorptionofTraceElements

Functions&DeficienciesofTraceElements

Iron(Fe),Zinc(Zn),Iodine(I),Selenium(Se)

WhyDoTraceElementsDeficienciesOccur?3当前第3页\共有74页\编于星期四\19点Definitions

Marcoelements

Includecalcium(Ca),phosphorus(P),magnesium(Mg),sodium(Na),potassium(K)andchloride(Cl),etc.Macroelementsarerequiredinamountsgreaterthan100mg/day.占人体质量万分之一以上4当前第4页\共有74页\编于星期四\19点Definitions

Microelements

Includeiron(Fe),zinc(Zn),copper(Cu),selenium(Se),fluorine(F),iodine(I),etc.低于人体质量万分之一Requiredinsmallquantitiesandarealsoknownas‘traceelements’5当前第5页\共有74页\编于星期四\19点

Macronutrientsinclude：MacronutrientsVS.Micronutrients

Protein

Lipids

Carbohydrates6当前第6页\共有74页\编于星期四\19点MacronutrientsVS.Micronutrients

Micronutrientsinclude:macromicro

Minerals

Vitaminsfatsoluble(VitaminA,D)watersoluble(VitaminB,C)维持人体的正常生理代谢，摄入不足会导致严重的疾病，甚至造成死亡！7当前第7页\共有74页\编于星期四\19点AbsorptionofTEs

Digestion/absorption

吸收：胃肠道，呼吸道，也可以是皮肤8当前第8页\共有74页\编于星期四\19点AbsorptionofTEs

Excretion

主要通过消化道（粪便）、肾脏（尿），呼吸、汗液也可排出少量9当前第9页\共有74页\编于星期四\19点AbsorptionofTEs

pHaffectsabsorptionofTEsSomeminerals(Ca,Fe,Zn,Cu)arepresentinfoodsasinsolublesalts.Mineralsfromfoodsaresolubilizedinthestomachduetotheacidity(HCl).Thissolubilitydoesnotlastlong,sincetheintestineismorealkaline(pH~7).10当前第10页\共有74页\编于星期四\19点AbsorptionofTEs

pHaffectsabsorptionofTEs

Anantacidwithourfoodsdonot

favorthesolubilityandabsorptionofTEs.Why?pHofstomachisincreased.Inalkalineenvironments,TEstendtoprecipitateandnotbeabsorbed(insteadareexcreted).WhetherprecipitationofTEshappenornotdependsonthepresenceofcertainfoodcomponentsthatbindtotheTEs,andenhancetheirabsorption(‘enhancers’)Therearealsomineral‘inhibitors’.enhancer(VitC)inhibitor(phytate)11当前第11页\共有74页\编于星期四\19点AbsorptionofTEs

FoodscomponentsaffecttheabsorptionofsomeTEs

Iron(Fe)absorption：

EnhancedbyvitaminCandmeat

Inhibitedbyfiber,phytate,tannins(tea),

oxalate(spinach)andcertainproteins(soybeanprotein,eggprotein,casein)meatteaspinacheggoxalatetannin12当前第12页\共有74页\编于星期四\19点AbsorptionofTEsZinc(Zn)absorption：

Inhibitedbyfiber,phytateandtannins(tea)andoxalate(spinach)

Oxalate(oroxalicacid)presentinfoodslikechocolateandspinachbindstoTEsandinhibitstheirabsorption.Likewise,phytate(orphyticacid)presentinmanyplantcrops,isamineralinhibitor.oxalatephytatefiber13当前第13页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEs

Functions

Catalyticfunctionsofenzymesystem

Essential/assistantcomponentofhormoneandvitamin

FunctionalproteinImmunefunctionNucleicacid血红蛋白(Fe)维生素B12(Co)锌指(Zn)谷胱甘肽过氧化物酶(Se)14当前第14页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEs

DeficiencyVS.Excess

必需微量元素在机体中有一个最适浓度范围。当其不足即小于该范围时，就会导致生物体生长迟缓，繁殖衰退，甚至死亡；当其浓度超过某一限度时，则会引起中毒。15当前第15页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEsTable1:Recommendeddailyintakes(RDIs)oftraceelements16当前第16页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEs

Iron(Fe)

Irondeficiencyisthemicronutrientdeficiencymostprevalentintheworld.ItisfollowedbyvitaminA,iodineandzinc.Ironisapartofheme(亚铁血红素)presentin:hemoglobin(whichtransportsoxygeninblood)myoglobin(whichstoresoxygeninmuscle)cytochromesinvolvedintheelectrontransportchain(unit6)andincytochromeP450(involvedinmetabolismofdrugs,pesticides,carcinogens,alcoholmetabolism)血红蛋白(hemoglobin)肌红蛋白(myoglobin)17当前第17页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEs细胞色素C(cytochrome)Iron(Fe)Ironisalsoformspartofmanymetalloenzymesinvolvedinmanyreactionsoccurringinthebody.NADH-Q还原酶18当前第18页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEs

Irondeficiency

Deficiencyofironcanleadtofatigue,

anemia(wherehemoglobinlevelsdropbelow120g/dL),poorschoolperformanceandpoorimmunity,brainfunction,

prematurebirth,death.疲劳(fatigue)贫血(anemia)镰状红细胞贫血症19当前第19页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEsToxicity

Toxicitycouldoccurdueto(a)oversupplementation,(b)repeatedbloodtransfusions,or(c)ageneticdisease

thatpredisposesindividualtoabsorbFe(hemochromatosis)Fedeficiencyisasdeleterioustohumanhealthasironoverload.Why?Feparticipatesinthe

Fentonreaction,whichresultsintheproductionoffreeradicals.Thesefreeradicals

damagecellmembranes(phospholipids),proteinsandDNA/RNA.芬顿反应20当前第20页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEs

Zinc(Zn)

Zincplayskeyrolesingrowthandimmunity.生殖发育味觉和食欲视觉免疫功能21当前第21页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEs

HowtodetermineZnstatus?

Itisdifficulttodeterminewhetherapersoniszincdeficient.

MeasuringZnlevelsinbloodisnotreliable,sincezincchangeswiththetimeoftheday.Ithasacircadianrhythm.Znlevelsarealsoaffectedbyillnessandperiodsofrapidgrowth.Othersmethodsinvolve:Measuringlevelsofalkalinephosphataseoralcoholdehydrogenaseinbloodwhichareenzymesthat

requirezinc

ZincconcentrationsinhairItisdifficulttodiagnoseZndeficiencysincesymptomsaresimilartothoseofFedeficiency.碱性磷酸酶(ALP)乙醇脱氢酶22当前第22页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEs

Zincdeficiency营养性侏儒症(伊朗乡村病)肠源性肢体皮炎厌食原发性男性不育症(primarymaleinfertility)口腔溃疡(dentalulcer)夜盲症(visusdiurnus)23当前第23页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEs

Iodine(I)

Iodineformspartoftwohormonessynthesizedbythe

thyroidgland.

Tetraiodothyronine(T4)Triiodothyronine(T3)About90%ofthehormonereleasedbythethyroidglandisT4,while10%isT3.四碘甲腺原氨酸(T4)三碘甲腺原氨酸(T3)24当前第24页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEsIodinedeficiencydisorder(IDD)Iodinedeficiencyisthemostimportantcauseofbraindamageandmentalretardation.IDDconsistsofawidespectrumofdisordersrangingfromsimplegoiter,characterizedbyanenlargementofthethyroidgland,tocretinism,anirreversibleformofmentalretardation.甲状腺肿呆小症(克汀病)智力缺陷25当前第25页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEs

Selenium(Se)

Seleniumisincorporatedintoproteinstomakeselenoproteins,whichareimportantantioxidantenzymes.Theantioxidantpropertiesofselenoproteinshelppreventcellulardamagefromfreeradicals.Seleniumalsoparticipatesinthyroidhormonemetabolism.GSH-Px26当前第26页\共有74页\编于星期四\19点Functions&DeficienciesofTEsSeleniumdeficiency克山病(Keshandisease)大骨节病(Kashin-Beksyndrome)白内障(caligolentis)27当前第27页\共有74页\编于星期四\19点WhydoTEsdeficienciesoccur?

Poorconsumptionofminerals.

lowtraceelementsintakeHighconsumptionoffoodsthatinhibittheirabsorption.

Phytate(plantfoods)inhibitsCa,Zn,Fe;chemicalspresentincassava,cabbage,turnipsaffectsImetabolism;oxalates(spinach)affectsCa&Fe

lowtraceelementsbioavailability28当前第28页\共有74页\编于星期四\19点BioavailabilityofTEs

Definition

HowtoEvaluateBioavailabilityofTraceelements?

Invivomodel

InvitromodelCellmodelOurresearchwork29当前第29页\共有74页\编于星期四\19点BioavailabilityofTEs

Definition

Bioavailability,i.e.thepercentage

oftheingestedamountoftheelementthatcanbeabsorbedduringdigestionandsubsequentlytransformedintometabolicallyactivespecies.

HowtoevaluatethebioavailabilityofTraceElements

Invivomodel

InvitromodelCellmodel人体消化系统30当前第30页\共有74页\编于星期四\19点InVivoModel

Bioavailabilityshouldbedeterminedbyinvivo

measurements

Ideally,thiskindofresearchshouldhavebeenperformedinhumans.

Advantage:ideal,reliableandactualmethodAnimalassays(mice,wistar,rabbit,piggy)humanWistachickenminipigrabbitmodelanimals31当前第31页\共有74页\编于星期四\19点InVivoModel

Bioavailabilityshouldbedeterminedbyinvivo

measurements

whereI=intake,F=faecalexcretion,andU=urinaryexcretion.

Disadvantageofinvivomodel

Invivomethodsusingradiotracersinhumansgivethebestestimationofbioavailability,buttheuseofradiotracerspresentproblemsinmanylaboratories(expensiveorunavailableformanykeytraceelements)

difficult&laboriousradiotracer32当前第32页\共有74页\编于星期四\19点InVivoModel

Disadvantageofinvivomodel

ethicalscruple

oftheuseofhumansubjectssignificantdifferencebetweenindividualsanimalabsorptionstudiesaresomewhatlimitedbyuncertaintieswithregardtodifferencesinmetabolismbetweenanimalsandhumans.

33当前第33页\共有74页\编于星期四\19点InVitroModel

Invitromethodshavebeendevelopedtoevaluatetraceelementsbioavailability

Milleretal.firstly(1981)developedaninvitromethodbasedonelementdialysabilitytodetermineironbioavailability.Theinvitromethodsareusuallybasedonthesimulationofgastricandintestinaldigestionoffoodandmeasurethefractionoftheelementavailableforabsorption.

Theinvitromethodsofferanappealingalternativetoanimalandhumanmodels.DennisD.Miller

gastricjuice:HCl(pH1.5~2.0),pepsin34当前第34页\共有74页\编于星期四\19点InVitroModel

InvitromethodshavebeendevelopedtoevaluatetraceelementsbioavailabilityAdvantage:Thesemethodsaresimple,rapid,inexpensiveandeasytocontrol.EvaluationofbioavailabilityofTEsinvolvesmeasurementoftheTEs

solublefractionortheTEsfractionthatdialysesthroughasemipermeablemembraneofacertainporesize(molecularweightcutoff,MWCO).pancreaticjuice(pH7.8~8.4):pancreatin,bilesaltandHCO-3

Dialysis(passivetransport)35当前第35页\共有74页\编于星期四\19点InVitroModelInvitrodigestionmethod(dialysismethod)36当前第36页\共有74页\编于星期四\19点InVitroModelInvitrodigestionmethod(solubilitymethod)SAMPLE(25g)+75mLgastricjuice(pepsine,sodiumchloride,pH=1.8)Shakingwaterbath(pH=3,37℃,4h)Centrifugation3500rpmSupernatantatpH2.5AdjustpH=6.8(NaHCO3)+50mLintestinaljuice(pancreatin,sodiumchlorideandbilesalts)Shakingwaterbath(37℃,4h)AdjustpH=7,centrifugation3500rpm,filtration(0.45m)SupernatantatneutralpHGASTRICDIGESTIONINTESTINALDIGESTION37当前第37页\共有74页\编于星期四\19点InVitroModel

Invitromethodshavebeendevelopedtoevaluatetraceelementsbioavailability

DisadvantagetheinvitromethodsonlymeasuretheamountofTEsavailableinthegastrointestinaltractforabsorption,i.e.,itsso-calledbioaccessibility.

passivetransportation

invivoconditionscanneverbecompletelysimulatedunderinvitroconditions.(factors:enzymeactivity,ioniccomposition,digestiontimesandpH)

staticgastrointestinalmodelsvs.dynamicgastrointestinalmodels38当前第38页\共有74页\编于星期四\19点InVitroModel

Dynamicgastrointestinalmodels

afollowingstreamofdialyzingsolutiondialysatepHwasmonitoredAdynamiccontinuous-flowdialysismethodDialyzedcomponentswarecontinuouslyremovedinthedigestivetract39当前第39页\共有74页\编于星期四\19点CellModel

Cellculturemodelshavealsobeenutilizedaspartofinvitrodigestionmodels.

TheCaco-2cell(thehumancolonadenocarcinomacelllines)culturemodelhasbeenwidelyusedasapredictivetoolfortheabsorptionofbioactivecomponentsfromfoodsandpharmaceuticalpreparations.Theinvitrodigestion/Caco-2cellculturemodeldevelopedbyGlahnetal.(1998)Othercellmodels：MDR1-MDCK,MDCK,ECV304.GlahnR.P.

40当前第40页\共有74页\编于星期四\19点Caco-2单层细胞模型

Caco-2单层细胞模型特点

在一定条件下培养时，能产生细胞极性，形成刷状缘，分化出绒毛面顶侧（Apical,AP）和基底侧（basolateral,BL），形成类似小肠上皮细胞。

优点：与人体小肠上皮细胞在形态和功能上十分相似。在肠腔侧分化出的绒毛面含有典型的小肠微绒毛水解酶（如蔗糖酶、氨基肽酶和蛋白酶等）和各种营养物质转运载体[如P-糖蛋白（P-gp），多药耐药蛋白（MRP）、二价金属离子转运载体等]。用于研究小肠的吸收特征。Caco-2细胞单层示意图（人体结肠及直肠癌细胞）41当前第41页\共有74页\编于星期四\19点Caco-2单层细胞模型

Caco-2单层细胞培养

Caco-2细胞单层培养模型

Transwells聚碳酸酯膜测定跨膜电阻（transepitheliumelectricalresistance，TEER）

确定细胞单层的完整性和紧密性观测细胞形态特征，验证其完整性42当前第42页\共有74页\编于星期四\19点Caco-2单层细胞模型

Caco-2单层细胞模型标准操作规程

转运实验示意图王夔院士（北大）

APBL或BLAP双向转运后，测定AP或BL侧培养液中待测物含量（转运量）和细胞中待测物含量（摄取量），两者总和为物质的吸收量，用于评估生物利用性。43当前第43页\共有74页\编于星期四\19点Caco-2单层细胞模型

Caco-2单层细胞模型标准操作规程

测定加入转运蛋白抑制剂后TEs在Caco-2细胞单层模型中的表观渗透系数（apparentpermeabilitycoefficient,Papp），确定TEs的转运机制（主动运输或被动运输）。

Caco-2单层细胞模型缺点Caco-2细胞在模拟小肠上皮细胞时存在缺乏分泌粘液的杯状细胞，缺少小肠上皮中黏液层的模拟。44当前第44页\共有74页\编于星期四\19点汞元素生物利用性研究

朱砂中汞元素生物利用性研究的实验条件（体外消化透析法）图1液/固比对朱砂中汞元素溶出率的影响图2

pH对朱砂中汞元素溶出率的影响45当前第45页\共有74页\编于星期四\19点汞元素生物利用性研究

朱砂中汞元素生物利用性研究的实验条件（体外消化透析法）图3胃蛋白酶量对朱砂汞的溶出率的影响图4接触时间对朱砂中汞元素溶出率的影响46当前第46页\共有74页\编于星期四\19点汞元素生物利用性研究

朱砂中汞元素生物利用性研究的实验条件（体外消化透析法）图5胰液胆盐量对朱砂中汞相对透析率影响图6透析时间对朱砂中汞透析率的影响47当前第47页\共有74页\编于星期四\19点汞元素生物利用性研究含朱砂中成药中汞的健康风险评估指标的提出总汞量不能客观地反映出朱砂对人体的毒副作用。基于对朱砂和含朱砂中成药中汞元素生物可接受率的测定，提出评价含朱砂中成药汞的汞生物可接受量限度，以含朱砂中成药中汞的生物利用性评价其安全性。人体内蓄积汞量达到2mg•kg–1表现为中毒，以成人体重60kg计，易知人体内蓄积120mg汞可表现汞中毒。汞在人体内半衰期为65~70d，以70d计，设日摄入含朱砂中成药中汞生物可接受量为m（单位mg），服用f天后，人体内蓄积汞量N可表示为：

48当前第48页\共有74页\编于星期四\19点汞元素生物利用性研究

朱砂中汞元素生物利用性研究（体外消化透析法）

含朱砂中成药中汞的健康风险评估指标阈值：1.19mg/（人•天）49当前第49页\共有74页\编于星期四\19点汞元素生物利用性研究

植物源成分对复方芦荟胶囊中汞生物利用性的影响图7几种植物化学物质源食品对复方芦荟胶囊中汞生物利用性的影响

50当前第50页\共有74页\编于星期四\19点汞元素生物利用性研究

植物源成分对复方芦荟胶囊中汞生物利用性的影响

图7几种植物化学物质源食品对复方芦荟胶囊中汞生物利用性的影响51当前第51页\共有74页\编于星期四\19点汞元素生物利用性研究

植物源成分对复方芦荟胶囊中汞生物利用性的影响

图7几种植物化学物质源食品对复方芦荟胶囊中汞生物利用性的影响52当前第52页\共有74页\编于星期四\19点汞元素生物利用性研究汞中毒剂量反推评估模型参考日本熊本和新泻水俣病患者所摄入有毒鱼贝的汞浓度和估计摄入量而推算出体内100mg的蓄积量为中毒剂量以及边振考等人曾报道人体汞蓄积中毒量为100mg。汞在人体内半衰期为65~70d，为计算简单此处以70d计，设日摄入含朱砂中成药中汞生物可接受量为m（单位mg），服用f

天后，人体内蓄积汞量N可表示为：

53当前第53页\共有74页\编于星期四\19点汞元素生物利用性研究汞中毒剂量反推评估模型汞生物可接受量超过0.099mg/（人·天）将对人体存在较大中毒风险54当前第54页\共有74页\编于星期四\19点生物强化研究概况

研究背景:人体微量营养素营养不良（MicronutrientMalnutrition，MNM

）

微量营养素（Micronutrients，即微量元素和维生素）是维持人体正常生命活动的必需营养物质，量微而作用大。如Fe、Zn、I、Se等微量元素在人体中承担着多种重要的功能。

Humansrequirevariousmineralelements.Somearerequiredinlargeamounts,butothers,suchasFe,Zn,Cu,IandSe,arerequiredintraceamountsbecausehigherconcentrationscanbeharmful.55当前第55页\共有74页\编于星期四\19点生物强化研究概况56当前第56页\共有74页\编于星期四\19点

基本上，这些矿质元素（mineralelements）都是通过植物（谷物等主食）进入人类食物链中。食用作物中矿质元素的缺乏以及人体对其较低的生物利用性（bioavailability），导致人体微量营养素缺乏，也称之为“隐形饥饿”（hiddenhunger）。生物强化研究概况57当前第57页\共有74页\编于星期四\19点

原因：①主食（staplefood）中微量营养素本身（inherent）含量较低，尽管蔬菜、水果和动物源食品富含微量营养素；②植物生长的环境土壤中矿质元素缺乏；③植物对土壤中矿质元素利用能力（phytoavailablilty）较低。

食物中矿质元素的化学形态（chemicalform）决定了人体对其吸收和同化（absorbandassimilate）的能力。

Someessentialmineralelements,suchasKandNa,occursolelyassolubleinorganicionsinplants.However,mostmineralelementsalsooccurinorganiccompoundsorinorganicsalts,inbothsolubleandinsolubleforms.生物强化研究概况58当前第58页\共有74页\编于星期四\19点植物体内含有促营养物质（promoter）和抗营养物质（antinutrients），影响人体对其必需矿质元素的吸收。促营养物质：抗坏血酸（ascorbate），β-胡萝卜素（β-carotene）和胱氨酸多肽（cysteine-richpolypeptides）等。抗营养物质：草酸（oxalate），鞣酸（polyphenolics）和植酸（phytate）等。

世界范围内人群受到微量营养素缺乏的不良影响。Itisestimatedthat,oftheworld’s6billionpeople,60-80%areFedeficient,>30%areZndeficient,30%areIdeficientandabout15%areSedeficient.生物强化研究概况59当前第59页\共有74页\编于星期四\19点Itisestimatedthatatleast1/3oftheworldpopulationisaffectedbytheZndeficiencyproblem,particularlychildren.Nearly450000childrenunder5yearsdieannuallybecauseofZndeficiency.生物强化研究概况60当前第60页\共有74页\编于星期四\19点控制人体微量营养素缺乏的传统策略不能普遍成功。传统策略：饮食多样性（dietarydiversification），矿物质补充（mineralsupplementation），食品强化（foodfortification）。生物强化研究概况61当前第61页\