CHIP1-教学讲解课件

染色质免疫沉淀及其测序Chip-seq王雅琪1ppt课件目录简介技术原理技术流程应用优缺点测序2ppt课件一、简介ChIP

是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系。3ppt课件二、原理染色质免疫沉淀技术（chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP）的基本原理是在活细胞状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联，超声波将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后用所研究的目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合体，从而特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。4ppt课件技术示意图5ppt课件三、技术流程具体操作流程6ppt课件1、甲醛交联细胞具体步骤7ppt课件2、染色质超声断裂1.加SDS裂解溶液重悬浮沉淀，冰上10min。每1min颠倒摇动一次离心管。2.把DNA粉碎为长度200-1000bp，置于冰上。(不同样本都进行超声条件优化实验)3.14000rpm离心10min(4℃)，转移上清于1.5ml离心管。8ppt课件3、免疫沉淀蛋白和DNA复合物9ppt课件4、收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA）10ppt课件5、洗脱免疫复合物11ppt课件6、去除甲醛交联解交联：加入20ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M).混匀,65℃,解交联过夜。12ppt课件7、DNA纯化1、酚-氯仿抽提2、硅胶柱纯化13ppt课件8、染色质免疫共沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定1.如果目的蛋白靶序列已知，或怀疑某一序列是目的的蛋白靶序列，则可选用定量或者半定量PCR方法。2.如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因组分布情况，找出转录因子结合位点，则可采用ChIP克隆测序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法14ppt课件四、应用1.组蛋白修饰研究2.转录调控分析3.药物开发研究4.有丝分裂研究5.DNA损伤与凋亡分析15ppt课件五、优缺点优点：充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况，可以找出生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。缺点：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得；为了获得高等丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因获取可能需要限制在组织来源。16ppt课件注意事项1、抗体与目的蛋白结合的有效性和特异性ChIP所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。所以不是所有的抗体都能做ChIP实验的，只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体，只有其他用途的抗体时，可以先做蛋白质免疫沉淀检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白，再进行染色质免疫沉淀实验的检测。17ppt课件2、交联的条件交联所用的甲醛终浓度约为1%，而交联时间需要预实验来确定。通常的交联条件为室温10min。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。18ppt课件3、超声片段的大小打断后的染色质片段的长度应主要集中在200-1000bp左右。19ppt课件六、测序ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。20ppt课件应用领域（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；（