生物技术药物的制造进程

生物技术药物的制造进程1第一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日获得目的的基因↓构建重组体↓构建基因工程菌(或工程细胞)↓大规模培养工程菌↓产物分离纯化↓除菌过滤↓半成品检定↓制剂↓成品检定↓包装生物技术药物生产一般过程

生物技术药物制造过程的主要程序是：获得目的基因→构建DNA重组体→将重组体导入宿主细胞→鉴定筛选阳性克隆→构建基因工程菌（或工程细胞）→培养工程菌→分离纯化表达产物→除菌过滤→半成品检定→制剂→成品检定→包装．2第二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日1、获得具有遗传信息的目的基因从复杂的生物体基因组中采用不同方法分离并获得带有目的基因的DNA片段。获得目的基因主要通过下述方法。(1)用限制性内切酶法直接分离目的基因质粒和病毒等DNA分子小的几kb,大的几百kb,编码的基因较少,直接用限制性内切酶法获得目的基因（2）人工合成目的基因人工合成目的基因主要采用下列3种途径。①酶促方法经提取获得编码基因的信息RNA（mRNA），在逆转录酶的作用下，合成互补DNA（cDNA）链，在DNA聚合酶I的作用下，加工成为双链DNA分子。②化学合成法前提是必须已知基因的核苷酸序列，化学合成的DNA片段一般较短，需要用DNA连接酶进行连接，从而获得较长的DNA片段。③聚合酶链反应（PCR）先决条件是必须已知基因的核苷酸序列，根据序列设计引物，进行PCR扩增获得的目的基因。也可以采用反转录PCR（RT-PCR）等方法，直接从富含目的基因的实验材料提取RNA，在逆转录酶的作用下获得cDNA，以此为模板进行PCR扩增获得目的基因。(3)构建基因组文库从cDNA文库分离目的基因3第三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2、选择基因载体构建重组NDA在体外将含目的基因的DNA片段和具有自我复制功能、并带有选择标记的载体分子进行酶切连接，获得重组DNA分子。常见基因载体有质粒、噬菌体（phage）、黏粒（cosmid）、病毒载体等。3、将重组DNA分子导入宿主细胞采用特定的方法将重组DNA分子转移至适当受体细胞（也称寄主细胞），并与之同步增殖。被导入的受体细胞分为两大类：第一类为原核细胞，目前常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等。第二类为真核细胞，其中真核微生物主要有酵母、丝状真菌等，此外为动物细胞、植物细胞。另外也可以导入动物和植物体。导入的方法主要有转化、转染等方法，此外也可采用电融合、显微注射和基因枪等技术。4第四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日4、鉴定带有目的基因的克隆从大量的细胞繁殖群体中，筛选出克隆有重组DNA分子的寄主细胞。为了挑选出重组子，针对不同基因的表达产物，采用各自特有的测活方法确定其生物活性；也可以采用酶联免疫方法确定其抗原性；以目的基因为探针，通过DNA杂交方法可以直接确定重组子。5、目的基因的扩增及获得目的产物培养克隆有目的基因的重组子，提取获得扩增的目的基因以进行深入的研究。将目的基因克隆至适当的表达载体，采用特定的方法将基因导入受体细胞，使其在新的遗传背景下获得活性表达，从而得到人类需要的特定目的物质5第五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日6第六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日6、大规模培养工程菌基因工程菌的培养过程主要包括：①通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体菌的影响；②通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案及顺序。由于工程菌生长和异源基因表达之间有着较大的差异，各培养参数在全过程中必须分段控制。在不同的发酵条件下，工程菌的代谢途径也不一样，因而对下游的纯化工艺会造成不同的影响。因此在高表达高密度发酵的前提下，还要尽量建立有利于纯化的发酵工艺，以提高产品的纯度及改善其性质。7第七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日7、根据研制产品的物理化学性质,选择合理的分离纯化方法基因工程产物分离纯化的费用约占整个生产费用的80%～90%，因此，该工艺过程理所当然地应受到高度的重视。然而基因工程产物的分离纯化过程与传统发酵产物相比，具有下列特点：（1）产物大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎，增加了很多困难；（2）产物浓度较低、杂质多、而最后成品要求达到的纯度高，故提取较困难，且收率低，常需好几步操作并需采用高分辨力的精制方法；（3）产物都是大分子蛋白质，通常不稳定，遇热、极端pH、有机溶剂和剪切力等易引起失活。各种产物表达形式所采用的分离纯化方法不同。纯化方法对重组蛋白的化学性质、构象等都有重要影响，合理的纯化方法至少要包括以下几方面:纯化步骤少产物的纯度、活性及其他检测指标达到规定要求得率高在确定纯化工艺时要多借鉴最新的分离纯化技术并计算相关技术成本,要考虑到将来生产工艺放大以后的可行性，在研制阶段所得出的实验数据,要为将来的生产放大提供充分的依据。在现实中,有许多厂家，企业拿到某种产品的新药证书和生产批文,但市场上迟迟见不到该品种上市的现象比比皆是，除生产厂家有自己的产品上市销售安排之外,生产工艺先天不足也是一个主要的原因。8第八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日分离纯化的一般流程9第九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日8、剂型，配方，规格和稳定性结合我国现阶段物流运输的实际情况,最好选择冻干剂型,冻干剂型易于运输和保存,但在冻干过程中产品易发生聚集,生物活性可能会受到影响，而液体制剂在临床使用上比较方便，合适的产品配方对产品的活性保持非常重要。根据剂型的特点和现有的同类产品的辅料,找出自己最合适的,并进行稳定性考察。选择合适的产品规格,对于产品的临床使用和上市销售非常重要，有些产品临床使用剂量大,而小规格的产品造成终端用户使用极不方便。根据药效学研究的结果,参照将来临床使用的剂量来确定合理的制剂规格，如果所开发的产品国外已经上市,应尽可能参照已上市产品的规格和剂型。稳定性考察是对产品的剂型、配方及储存条件确定的综合评价。特别是基因工程药物,稳定的生物活性是其安全有效的保证，应在充分研究同类或相近产品的稳定性考察温度和本品的生物化学性质的基础上,制订好考察周期,根据质检规程的要求进行检测为产品的有效期确定提供科学依据。10第十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日NDV-F（新城疫弱毒株）诱生人脐血干细胞，提取mRNA，反转录成DNA，构建质粒，经克隆筛选获得有目的基因的质粒pBV867,转化到大肠干菌中，干扰素基因在启动子控制下转录。发酵，收集对数期生长的的pBV867工程菌，用溶菌酶或高压匀浆破菌后，裂解液用85%硫酸胺盐析，酸化使70%杂蛋白变性，然后过CM-22和DEAE-22离子交换层析，分段洗脱，超滤浓缩，再过干扰素单抗亲和层析柱，可纯化2500倍，纯度达95%以下，经分装，冻干即成。11第十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日二、生物技术药品质量保证要素（一）药典（pharmacopia）（二）质量保证体系药品的质量保证起始于新药的研究与开发，并贯穿于生产销售和使用的各个环节。1.研究与开发者，临床前研究，GLP(goodlaboratorypractice药品非临床研究质量规范)2.临床研究单位，GCP(Goodclinicalpractice药品临床试验管理规范)3.药品生产企业，GMP(GoodManyfacturingpractice药品生产质量管理规范)4.药品经销商，GSP(Goodsupplyingpractice医药商品质量管理规范)5.医院，消费者，GUP(Goodusepractice医药商品使用管理规范)6.中药栽培企业，GAP（GoodAgriculrurePractice中草药栽培规范）7.医院药房和药剂科，GPP（GoodPharmacyPractice医院药房质量管理规范）QA（QualityAssurance

质量保证）——GMP——QC（QualityControl质量控制）

12第十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日13第十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日(三)生产车间与设备制药车间设备包括生产专门设施区、质量控制区和贮存区。洁净区是安装有制药设备并受严格环境洁净控制的区域，注射剂或无菌生物药物必须在洁净区生产，洁净区需特殊设计以防止产品受到污染，常见的污染物有微生物与颗粒物质。洁净区的环境监测：空气悬浮粒子标准监测微生物限度监测人员监测14第十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日纯化水和注射用水系统纯化水：为原水经离子交换法、反渗透法、蒸馏法或其他适宜方法制得的供药用的水，不含任何附加剂，可作为配制普通药物制剂用的溶剂或试验用水，不能于注射剂的配制。注射用水：为纯化水经蒸馏所得的水，应符合细菌内毒素实验要求，可作配制注射剂用的溶剂。(四)制药用水系统

15第十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日16第十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日注射用水制造流程图17第十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日（五）生产许可1、工艺规程阐述生产一定量的某一药品所需原料、辅料、包装材料、半成品和成品的质量标准及批生产处方，生产规程，作业方法，中间控制方法和注意事项的一套文件。2药品的批准文件新药证书或药品批准书药品生产许可证GMP批准文号：药品批准文号为：国药准字＋1位字母＋8位数字；化学药品使用字母“H”，中药使用字母“Z”，生物制品使用字母“S”，进口分包装药品使用字母“J”等。数字第1、2位为原批准文号的来源代码，。第3、4位为换发批准文号之年公元年号的后两位数字。数字第5至8位为顺序号。

3、生产方法(manufacturingmethod)生产某一药品标准批量的基本方法、流程及原则要求。注意生产处方与终产品处方的区别。

18第十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日4、生产过程控制方法及标准为保证药品批间质量的均一性，进行生产过程控制或中间品的质量控制，目的是监控生产全程，及时查明中间品和产品变异质量的偏差。5、原、辅料质量标准、如：糊精,乳糖,淀粉明胶,乙醇,甘油,壳聚糖,甲壳素,聚维酮,活性碳,凡士林,丙二醇,包衣粉,硬脂酸镁,聚乙二醇,空心胶囊,微粉硅胶,纤维素系列等6、质量标准成品质量标准分为外控质量标准和内控质量标准。外控标准就是产品的注册标准或法定标准(如药典标准、部颁标准)、内控标准是企业控制标准，一般检查项目多于外控标准或项目的限定指标严于外控标准或二者兼有。19第十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日7、包装材料质量标准8、稳定性考察药品稳定性是指药品保持其物理、化学、生物学稳定性及其疗效和安全性的能力，确保药品在有效期内的安全性与有效性。包括三部分内容：影响因素试验，加速试验和长期留样考察。9、变更控制和登记20第二十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日一、生物技术药物表达系统（一）原核生物细胞1、大肠杆菌A.表达方式细胞内不溶性表达：包含体胞内可溶性表达：分离纯化较困难细胞周质表达：用渗透振扰法分离产物,可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确折叠，或去除N--末端的甲硫氨酸，胞外分泌型表达：通过信号肽携带等操作，是最优选的方法。第二节生物技术药物来源与质量控制21第二十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日

1）

细胞内不溶性表达产物包涵体的分离纯化包涵体是在大肠杆菌高表达系统中,某些目的蛋白质以不溶性形式产生并聚集形成蛋白质聚合物。包涵体可以较容易地与胞内可溶性蛋白杂质分离，但因包涵体中重组蛋白质产物经过了一个变性复性过程，较易形成蛋白产物的错误折叠和聚合体包涵体的分离及其中重组蛋白质的纯化通常包括以下步骤（1）.菌体细胞的收集与破碎；

（2）.包涵体的分离、洗涤与溶解；

（3）.变性蛋白质的纯化；（4）.重组蛋白质的复性。2）

分泌型表达产物的分离纯化分泌型的表达产物通常体积大、浓度低、必需在纯化以前进行浓缩处理，尽快缩小溶液体积。超滤是目前最常用的蛋白质溶液浓缩方法。其优点是不发生相变化，也不需要加入化学试剂，能耗低。

22第二十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日3）

大肠杆菌细胞内可溶性表达产物的分离纯化某些细胞因子（如白细胞介素2、11）和硫氧还原蛋白的基因能在大肠杆菌胞内表达可溶性的融合蛋白。这种表达方式可避免无活性的不可溶包涵体的形成，使外源蛋白在细胞中能正确折叠,从而获得特定空间结构和生物功能,并以可溶性形式表达。经细胞破碎后的可溶性离心上清液，可选用亲和层析法或离子交换法分离纯化4）

大肠杆菌细胞周质表达蛋白的分离纯化周质表达的蛋白可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，有利于蛋白产物的分离纯化,通常能够回收到高质量的蛋白产物。为了获取周质蛋白，细胞经低浓度溶菌酶处理后，一般用渗透压休克（先用高渗蔗糖（20%）处理细胞，再用低渗溶液处理细胞使其胀破，此时便可对释放出来的胞浆蛋白质进行分离）的方法获取。23第二十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日24第二十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日B.不足分泌能力不足，真核蛋白在E.coli中常形成不溶性包含体，表达产物必须变性和复性处理才能使目的蛋白恢复生物活性。在E.coli表达体系中不存在翻译后修饰作用，对蛋白质产物不能进行糖基化，因此只能用于表达不需糖基化作用的真核蛋白。由于翻译常从起始密码子AUG(甲硫氨酸)开始，因此目的蛋白的N末端常多了一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌还会产生内毒素，故目的产品应作内毒素检测产生蛋白酶会破坏目的蛋白C解决方法：降低培养温度(从37℃降到30℃)以硫氧还原蛋白为载体进行融合蛋白表达

25第二十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物,它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物,而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。类脂A是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。该基团没有种属特异性,所以各属细菌的类脂A结构相似,其毒性反应相似。如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血,并导致休克等。内毒素不是蛋白质,热稳定性强。在100℃的高温下加热1h也不会被破坏,115℃30min湿热仅能破坏25%左右的热原质。只有180℃3~4h或250℃1~2h干烤,或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30min才能破坏它的生物活性。内毒素带有负电荷,由于脂多糖结构中类脂A的疏水性,使得内毒素倾向于以高分子聚合物的状态存在而难溶于水,并由于环境中Ca2+、Mg2+等被吸引到带负电荷的脂多糖上而得以稳定。通常其分子量几十万至上百万道尔顿。26第二十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日内毒素的产生

基因工程蛋白通常采用细菌、酵母、哺乳动物细胞或昆虫细胞作为宿主进行大规模发酵生产,但大多是以大肠杆菌作为表达系统。以大肠杆菌作为表达系统的蛋白通常都是在胞内表达,在纯化蛋白之前必须通过高压匀浆、超声波破碎或低压渗透等方法将菌种破壁,以释放蛋白。同时细胞壁内的脂多糖也大量释放到缓冲液中,通常10%的湿菌浓度可产生内毒素,这是内毒素的主要来源。生产中去除内毒素，主要是采用各种柱层析技术,如疏水层析、离子交换、亲和层析、分子筛等,这些技术纯化目标产品的同时也可以有效去除内毒素。27第二十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2枯草芽孢杆菌

A、优点：分泌能力强，表达产物可直接分泌到培养液中，不形成包含体。B缺点：不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会降解表达产物。3链霉菌A特点：不致疾、使用安全、分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力。B缺点：操作比大肠杆菌复杂，转化或转化频率低用于基因表达的启动子少。28第二十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日（二）真核生物细胞1、酵母A特点：酵母易繁殖，可以大规模廉价培养，而且没有毒性，能将表达产物分泌到细胞外，表达产物能糖基化，在细菌中难于表达的真核基因在酵母中可获得高效表达。它有以下特点：①是真核表达体系，对表达蛋白可进行折叠和翻译后修饰与糖基化；②表达量高，如明胶表达量达14.8g/L;③培养基成本低；④适用高密度发酵；⑤杂蛋白少，产物易纯化。B缺点色素难以除去啤酒酵母表达量偏低；大量表达时，常会有质粒丢失；重组蛋白发生超糖基化；分泌蛋白留在壁膜间隙，增加了纯化难度。毕赤酵母表达系统优于啤酒酵母。29第二十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2、哺乳动物细胞A优点：哺乳动物细胞可将表达产物由重组转化细胞分泌到培养液中，使产物易于纯化。哺乳动物细胞分泌的表达产物是糖基化的，接近或类似天然产物。可获得结构与天然蛋白相一致的活性蛋白，对于制造结构复杂的生物药物是其它系统所无法比拟的。B缺点：细胞生长缓慢、生产效率低、培养条件苛刻、费用高，培养液中产物浓度稀，因此生产成本高，扩大生产规模有较大困难。常用的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵细胞(CHO细胞)和幼仓鼠肾细胞(BHK)30第三十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危险性大肠杆菌多肽、蛋白质或融合蛋白质菌体内容易部分可获高产一般对原核者好真核者稍差不大酵母多肽、蛋白质或糖基化蛋白菌体内或分泌出细胞容易可高产菌体内稍复杂真核的接近天然不大哺乳动物细胞完整糖基化蛋白分泌出细胞较难、成本高可高产简单几乎可为天然产物需注意有致癌因素31第三十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日考虑事项大肠杆菌酵母哺乳细胞ＤＮＡ的大小和特点4.6Mb，环形ＤＮＡ12.1Mb，染色体ＤＮＡ2000-3000Mb，染色体ＤＮＡ翻译后修饰没有可能，但不同于人可能，类似或同人一样生长率（每小时循环数）3.33/h0.25/h0.02/h培养方法发酵发酵发酵（悬浮细胞）转瓶（粘附细胞）成本低中间>100万美元／kg在制药规模上选择宿主细胞用于重组药物的表达中一些关键事项的比较32第三十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日3昆虫细胞表达系统昆虫细胞可进行信号肽的切除，糖基化等蛋白质翻译后加工，并能进行适当的细胞分区和胞外分泌表达。主要包括杆状病毒表达系统、稳定转化系统（stabletransformationsystem）两种。杆状病毒表达系统将目的基因克隆至带有编码杆状病毒多角体或P10启动子的转染载体上，获得重组杆状病毒，感染昆虫细胞［sf-9，sf-2］，BTI-ΤΝ-5Β1-4（HighFiveTM）］进行表达。该系统表达的抗体尽管每个细胞的表达水平是原核细胞的50～100倍，但仍为可溶性。另外，杆状病毒有严格的宿主传导性，增加了该系统的安全性。稳定转化系统克服了病毒感染引起细胞死亡的缺点，Mahiouz等将抗E-选择素的单链抗体基因克隆于果蝇金属硫蛋白启动子下，转染果蝇细胞，筛选稳定转化的细胞克隆，培养上清中抗体含量达到0.2～0.4mg/L。33第三十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日4、转基因动物是指通过基因工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人为的修饰，并通过相应的动物育种技术使这些经修饰改造后的基因组在世代间得以稳定的传递和表达。动物基因组中稳定地整合含有外源性基因的动物。可以大容量、廉价地生产复杂蛋白建立转基因动物的几种途径受精卵或卵细胞DNA直接显微注射胚胎干细胞介导的基因转移逆转录病毒介导的基因转移精子介导的基因转移和育种体细胞基因转移和克隆34第三十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日

5转基因植物通过把分离的基因与来自植物、病毒、细菌的启动子相连接,然后再转移到植物受体细胞内来表达，外源基因整合到植物受体细胞染色体组上并复制，从而使外源基因能在植物细胞内高效稳定的表达。目前常用的启动子主要是CaMV35sRNA启动子,另外还有玉米泛素Ⅰ型启动子和水稻肌动蛋白启动子。内含子顺序常用于外源基因在单子叶植物中的表达。在植物中表达基因产物具有诱人的前景，如表达基因工程抗体可达叶总蛋白的1.3％。可大规模生产治疗和诊断用的医用抗体。生产成本比其它任何来源抗体都要低。植物细胞的糖基化与哺乳细胞相似，但能产生一些不同哺乳细胞的糖类残基（木糖残基），而缺乏哺乳动物常见的末端残基——唾液酸。

35第三十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日36第三十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日

由于转基因植物中形成的重组蛋白质具有相对稳定、表达量低、不易消毒、结构不易确定及翻译修饰后造成活性差异和生物活性取决于正确结构,甚至折叠方式等特点，因此必须制定相应的安全管理条例以确保使用这些药物和用做药品的这些产物(药物)的安全性和有效性。全面考虑转基因植物的遗传稳定性、微生物污染、纯度、产物的可比较性及环境影响和污染情况等众多因素并且制定必要的规范化管理条例是必要的,而且这样会积极推动本领域的研究工作。目前我国已有中国科学院、中国农业科学院基因工程安全管理办公室等单位专门负责此方面内容的申报及安全管理工作。37第三十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日38第三十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日二、生物技术药物制造过程的质量控制（一）原材料的质量控制原材料的质量控制主要是对目的基因、表达载体及宿主细胞的检查1．表达载体应提供有关表达载体详细资料，包括载体的生物学性质和来源、构建表达载体各组分的来源及性能，说明载体的结构、遗传特性和抗生素抗性标志物等。39第三十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2．目的基因

目的基因，应弄清其来源和克隆过程；加工过的基因应说明被修改过的密码子、被切除的肽段及拼接的方法；使用PCR技术的，应说明扩增模板、引物及酶反应条件，并应证明基因结构正确无误。

3.宿主细胞应提供宿主细胞的资料，包括细胞株（系）名称、来源、传代历史、检定结果及基本生物学特性等。

应详细说明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态应提供宿主和载体结合后的遗传稳定性资料。

40第四十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日该步最关健的质量控制在于保证基因的稳定性、一致性和不被污染。1．主细胞库（mastercellbank）

rDNA制品的生产应采用种子批（seedlot）系统。从已建立的主细胞库（MasterCellBank，MCB）中，再进一步建立生产细胞库（workingcellbank,WCB）。含表达载体的宿主细胞应经过克隆而建立主细胞库。应详细记述种子材料的来源、方式、保存及预计使用寿命。应提供在保存和复苏条件下宿主载体表达系统的稳定性证据。采用新的种子批时，应重新作全面检定。

（二）培养过程的质量控制41第四十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日对细胞库进行全面的特性鉴定，包括细胞库的来源、形式、贮藏、稳定等。对细胞库的质量控制往往采用细胞学方法、表型鉴定、抗生素抗性检测、限制性内切酶图谱测定、序列分析与稳定性监控等方法。

2.有限代次生产控制根据宿主细胞/载体系统的稳定性资料，确定在生产过程中允许的最高细胞倍增数或传代代次，应确定废弃批次培养物的指标，并应提供最适培养条件的详细资料。在生产周期结束时，应监测宿主细胞/载体系统的特性，例如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度、含插入基因的载体的酶切图谱。42第四十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日3.连续培养生产控制

基本要求同有限代次生产，应提供经长期培养后所表达基因的分子完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因型特征。每批培养的产量变化应在规定范围内。根据宿主/载体稳定性及表达产物的恒定资料，应规定连续培养的时间。如属长时间连续培养，应根据宿主/载体稳定性及产物特性的资料，在不同培养间隔时间作全面检定。43第四十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日（三）纯化过程的质量控制常用分级沉淀、超滤、电泳、色谱等技术，以去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋白、纯化过程带入的有害化学物质、致热原，或将其减少至允许量。亲和层析技术应注意Ab(砹)从载体脱落而污染产物如真核细胞表达的制品反复多次使用，要求纯度达98%以上；原核细胞表达的多次使用制品纯度达95%以上即可；应考虑纯度、纯化倍数、收率，应尽量不加入对人体有害的物质，若不得不加入，应设法除净，并在最终产物品中检测残留量，还要考虑到多次使用后的蓄积作用。44第四十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日(四)最终产品的质量控制(1)生物学效价测定：应尽量采用国际通用办法，用国家标准品进行校正，以动物体内试验或体外细胞培养法法测定制品的生物学活性，并标明其活性单位(如：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量)。变异性较大，必须采用标准品或对照品进行校正。（2）纯度测定：世界卫生组织规定用非还原SDS和HPLC两种方法测定，都应达到95%以上，有些制品甚至要求达到99%。45第四十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日（3）药物的比活性应测定蛋白质含量，计算出比活性，以活性单位/mg蛋白表示之，不仅是含量指标，也是纯度指标。由于蛋白空间结构的改变，特别是二硫键的错配，可能影响到蛋白质的生物学活性，而比活可以间接地反应这一情况。（4）理化性质鉴定A相对分子质量：分子筛层析法，还原型SDS（±10%），质谱B等电点测定：等电聚焦电泳法测定。重组药物的等电点往往不均一，但是生产过程中批与批之间的电泳结果应一致，以此控制生产工艺。C氨基酸成份分析：采用微量氨基酸自动分析仪测定，包括甲硫氨酸，半胱氨酸及色氨酸的准确值。结果应为三次分别水解样品测定后的平均值。在试生产的头三批或改变工艺时必须检测。

46第四十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日D部分氨基酸序列分析：中试前三批产品至少测N-端15个氨基酸；C-端1-3个AA序列

E肽谱分析：应用合适的酶或化学试剂使所选的产品片段产生不连续多肽，应用HPLC、SDS或其他适当的方法分析该多肽片段。不同的批次肽谱应一致，是工艺稳定性的重要验证指标。

F吸收光谱：对同一蛋白来说，其最大吸收波长是固定的，在生产过程中每批的紫外吸收光谱应当是一致。

G免疫原性：低免疫原性是衡量生物技术药物的质量高低的重要指标。因为由重组生成的药物，即使其氨基酸序列与天然蛋白质一致，其免疫原性也可能由于空间结构不同而高于天然提取的多肽药物

F鉴别试验：将rDNA制品与天然产品通过生物学比较试验，确定其与天然产品是一致的47第四十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日（5）杂质检测A蛋白质杂质：视制造工艺而确定，可分为三大类，来源于细胞基质，来源于培养基，来源于下游生产工艺，如宿主蛋白，小牛血清，结构相似的杂蛋白，产物降解或冷冻等产生的变构体等。B非蛋白类杂质：主要有细菌、病毒、热原质和DNA等病毒和细菌等微生物比蛋白质要大得多，可以采用各种过滤方法除去，终产品应遵照中国生物制品规程进行病毒污染检查和无菌试验。热原质的检查用注射家兔法或鲎（hou,甲壳类动物）试验法残留DNA测定：DNA含量<100pg/剂量，通常采用核酸杂交或利用高亲和力的DNA蛋白进行测定，前者对针对有特异序列的DNA，而后者对所有序列的DNA都可以检出。48第四十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日生物技术药物的质量控制:参照现行国家药典上同类或相近产品,制订出产品质量检定规程,并与国家食品药品监督管理局指定的药品检测机构保持密切合作。在现行国家药品法规制度下,确保产品安全有效,并考虑到放大生产时可能出现的问题,导致产品检测指标产生差异的可能性，根据产品特点和实验情况制订出合理的控制指标并确定好相应的检测方法。在检测项目中,如果现有药典上的方法不能有效地进行检测时,要与药品检测机构的专家进行有效的交流,提出合理的检测方法或从国外相关药典上选择,并提供充分的试验数据,使产品质量检定规程各项控制指标切实可行。若要确定蛋白质分子结构的均一性,还要对蛋白质分子进行紫外光谱，圆二色谱，核磁共振，及荧光光谱分析等49第四十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日50第五十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第三节生物技术药物的稳定性蛋白质类药物因其分子具有严格的三维结构，所以其生物活性不仅取决于其分子的一级结构，还与其空间结构的完整性密切相关。有两个主要因素影响它们的稳定性：①化学上的不稳定性，由多种因素引起的对蛋白质分子的化学基团进行化学修饰，引起原有化学键的断裂或形成新的价键形式。主要有：氧化作用，脱酰胺作用，水解作用，外消旋作用，β-消去反应等。②物理的不稳定性。主要是涉及到更高级空间结构的改变，包括蛋白质分子二级或高级空间结构的改变，这些改变的引起因素如：温度，pH等蛋白质类药物的物理性或化学性的降解可能发生在多种不同环节，包括制造生产过程、纯化操作过程、处方制剂及贮存流通使用过程。51第五十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日52第五十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日

不稳定氨基酸残基的化学降解途径不稳定氨基酸残基基本化学反应Asn，Gln脱酰胺、外消旋作用、异构化Asp水解作用、外消旋作用、异构化Met，Cys氧化作用His，Trp，Tyrβ-消去反应Ser，Thr，Cys外消旋化Cys二硫键交换53第五十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日一、生物技术药物的化学稳定性氨基酸的侧链是不稳定性：Asn赖氨酸，Asp天冬氨酸，Cys半胱氨酸，Gln谷氨酰胺，His组氨酸，Lys赖氨酸，Met甲硫氨酸，Phe亮氨酸，Ser丝氨酸，Thr苏氨酸，Trp色氨酸和Tyr络氨酸等残基的侧链常易发生各种化学反应，含不稳定侧链的氨基酸残基常常可通过非酶促反应，使共价键断裂或对分子进行共价修饰。54第五十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日1、水解作用（1）一般酸、碱、蛋白酶的水解（2）-X-Asp天冬氨酸-Y，含有Asp残基，在稀酸中更易水解（3）水解作用也常发生在蛋白质的酰胺键，Asn赖氨酸,Gln谷氨酰胺。（4）N末端临近Pro和Ser和Thr也易发生水解。蛋白质水解后发生的质量和大小变化可用HPLC，HPCE(高效毛细管电泳技术)，SEC（尺寸排阻层析）进行分析，用SDS及MS分析不同的水解片段。

55第五十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2氧化作用主要原因有两种：一是氧化剂的污染如在H2O2、多种过氧酸，N-氯代或溴代琥珀酰胺，过碘酸，碘等氧