实验3细菌的简单染色和革兰氏染色

革兰氏染色C.Gram（革兰）于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。当前第1页\共有22页\编于星期四\17点◆用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染◆用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。◆用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细胞呈无色。◆用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革兰氏阳性细菌继续保持深紫色当前第2页\共有22页\编于星期四\17点当前第3页\共有22页\编于星期四\17点实验三

细菌的简单染色和

革兰氏染色当前第4页\共有22页\编于星期四\17点细菌的简单染色和革兰氏染色一目的要求二基本原理三实验材料四无菌操作过程五操作步骤六实验报告七思考题当前第5页\共有22页\编于星期四\17点一目的要求1学习制染色片技术，学习简单染色\革兰氏染色原理，理解着色机理。学习并掌握无菌操作的技术。3掌握简单染色\革兰氏染色的方法，并能正确染色4巩固显微镜油镜的使用方法。当前第6页\共有22页\编于星期四\17点（一）细菌的简单染色原理（二）革兰氏染色基本原理二基本原理当前第7页\共有22页\编于星期四\17点细菌细胞微小，且含水量较多，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察，所以必须进行染色处理，使细胞着色，便于观察。简单染色是使用单一染料染色，可用于观察细菌形态、大小、及排列方式.染色前一般要将细胞固定，其目的是杀死菌体并使之粘附于玻片上，还可以增强菌体的着色能力。固定有加热法和化学法两种，无论采用何种方法均应维持细胞原有形态。（一）细菌的简单染色原理当前第8页\共有22页\编于星期四\17点（二）革兰氏染色基本原理革兰氏染色是用于细菌鉴别的一种重要染色方法。它是根据革兰氏阳性细菌、阴性细菌细胞壁结构、组成的不同而使用一系列的染色处理使之差别显色。其染色方法是先将细菌分别用结晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脱色，再经复染剂复染。最终被染成红色的是革兰氏阴性细菌；被染成紫色的是革兰氏阳性细菌。当前第9页\共有22页\编于星期四\17点占细胞壁的10%占细胞壁的90%当前第10页\共有22页\编于星期四\17点当前第11页\共有22页\编于星期四\17点1、细胞壁

革兰氏阳性细菌的细胞壁当前第12页\共有22页\编于星期四\17点革兰氏染色与细胞壁：革兰氏阳性\阴性细菌的细胞壁对比当前第13页\共有22页\编于星期四\17点革兰氏染色原理：第一步：结晶紫使菌体着上紫色第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。G+菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。当前第14页\共有22页\编于星期四\17点1234？当前第15页\共有22页\编于星期四\17点三实验材料大肠杆菌（24h培养）斜面菌种枯草杆菌（16h培养）斜面菌种当前第16页\共有22页\编于星期四\17点四无菌操作过程无菌操作：不让除我们接种的微生物以外

其它微生物侵入的技术。当前第17页\共有22页\编于星期四\17点当前第18页\共有22页\编于星期四\17点（一）简单染色操作步骤1涂片：载玻片、无菌水、斜面菌种、无菌操作、均匀的薄层2干燥：3固定：加热固定4染色：结晶紫染1min或蕃红染2-3min或石炭酸复红染1min。5

水洗：6干燥：7镜检：低倍镜观察以确定目标和范围，再换用油镜观察绘图。

五操作步骤当前第19页\共有22页\编于星期四\17点当前第20页\共有22页\编于星期四\17点（二）革兰氏染色操作步骤1涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。2初染：滴加结晶紫染色1min，后用水冲洗。3媒染：滴加碘液染色1---2min，后用水冲洗，甩尽残余水4脱色：用95%乙醇冲洗30秒（需要严格控制时间和浓度），然后立即用水冲洗。5复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，蕃红染2--