蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定

蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定作者刘艳芝 指导教师张玲秀（忻州师范学院生物系1201班034000）摘要：采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35°C。关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化蛋白酶蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60%，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。1、材料及方法：实验仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平，pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。1.2实验材料：样品：取自忻州师范学院附近的土壤。试剂：无菌水（带玻璃珠）、100ug/ml酪氨酸溶液、PH8.0硼酸缓冲液、0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培养基、酪蛋白培养基、产蛋白酶发酵培养基二、操作步骤（一） 配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白月东培养基：牛肉膏0.5g，蛋白月东1g，NaCl0.5g，琼脂1.5〜2.0g，水100ml，pH7.2，配制200mL酪蛋白培养基：牛肉膏0.3g，酪素1g，NaCl0.5g，琼脂2g，定容于100ml产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6g，豆粉4g，磷酸二氢钾0.03g，碳酸钠0.1g，磷酸氢二钠0.4g，定容于100ml（二） 分离洗涤培养皿、试管等实验器具，与121°C高压灭菌20min采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。取1:10土壤悬液5mL，注入己灭过菌的试管中，将此试管放入75°C恒温水浴中热处理10min,以杀死非芽孢细菌及其他微生物。取加热处理过的土壤悬液100〜200UL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30〜32C下培养24〜48h.（三） 筛选1、 从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，接种于酪蛋白培养基，30〜32C下倒置培养24〜48h。2、 选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌，接入产蛋白酶发酵培养基30-32C振荡培养48小时，将发酵液过滤或离心，取清夜检测蛋白酶活力进行复筛。（四） 蛋白酶活力的测定原理：蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在275nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。绘制标准曲线取7支试管，按下表加入试剂:项目0123456100ug/ml酪氨酸溶液（ml）00.10.20.30.40.50.6酪氨酸浓度（ug/ml）0102030405060PH8.0硼酸缓冲液6.05.95.85.75.65.55.40.4mol/1三氯乙酸（ml）5555555将各管溶液混匀，40°C预热2min，用滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm的吸光值，用Excel软件求回归方程，并计算出1ug/ml酪氨酸的吸光值。实验步骤（1） 取5ml用PH8.0硼酸缓冲液制备的0.6%酪蛋白溶液于试管中，40C保温20min后加入1：20以PH8.0硼酸缓冲液稀释的酶液1ml，40C反应10min后，加入5ml0.4mol/ml三氯乙酸以终止反应，并沉淀残余底物，40C保温20min使沉淀完全，用漏斗加滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm的吸光值。（2） 空白组先加三氯乙酸使酶失活，后加酪蛋白，按上述同样步骤测定吸光值。计算酶活力以1min内有酪蛋白释放的三氯乙酸可溶物在275nm的吸光值于1ug酪氨酸相当时，其所需要的酶量为1个单位。酶活（U/ml）=Al-A0 xn10xA.A〕-A”

xnIOxA3A1 酶反应可溶物的吸光值，A0 空白对照可溶物的吸光值，A2 1ug/ml酪氨酸的吸光值实验结果及数据分析：实验所测标准曲线数据如下：试管号0123456酪氨酸的浓度（ug/ml）0102030405060A275下的吸光值00.0210.0280.0360.0460.0570.073标准曲线绘制如下:册白活力的湄亍.I；：o.IV0.II.册白活力的湄亍.I；：o.IV0.II.一IE(I.1'二40 £酪劄段独3.国）*女元笙一戏性您壬度;由图中可知，线性关系为y=0.0011x+0.0042在实验