蚕豆根尖微核检测

蚕豆根尖微核检测指导老师：吴麟

组长：路青瑜小组成员:何悦李婷陈鸿谭小娥刘清唐珍冯沁李双吴海林符方亮摘要：本实验运用蚕豆根尖微核检测技术，分别用0.25mg/mL染发剂、0.5mg/mL洗洁精对蚕豆根尖做处理，同时以0.25mol/L叠氮化钠处理蚕豆根尖做阳性对照，自来水作阴性对照。镜检后测得其微核率分别为17.55%，19.82%，23.18%，11.16%；染发剂、洗洁精处理的污染指数分别为1.7、1.8，结果表明均属于轻度污染。关键词：蚕豆微核检测微核率Abstract：Thisexperimentusingviciafabamicronucleustesttechnology,respectivelyfor0.25mg/mLcolourants,0.5mg/mLofviciafabadetergent,atthesametimetodoprocessingmol0.25/sodiumazideprocessingviciafabadopositive,negativecontrolforwater.Afterthemicroscopicmicronucleusrate17.55%respectively,19.82%,23.18%,11.16%,Hair,detergentpollutionindexrespectivelywith1.7,1.8,resultsshowthatbelongtolightpollution.Keyword：Horsebeanmicronucleustest；micronucleusrate引言：染发剂和洗洁精都是我们生活中的日用品，特别是洗洁精。化学去污剂主要分为阳离子型、阴离子型和非离子型3类（其中阴离子型表面活性剂使用频率最高）。国内学者采用该技术开展了水体污染物、环境污染物和合成洗涤剂方面的研究。生活洗涤剂侵人人体后与其它的化学物质结合后，毒性会增加数倍，尤其具有很强的诱发癌特性。据有关报导，人工实验培养胃癌细胞、注入化学洗涤剂基本物质LAS会加速癌细胞的恶化。LAS的血溶性也很强，容易引起血红蛋白的变化，造成贫血症。染发剂主要成分为：氨水、对苯二胺。市场上绝大部分染发剂都含有致癌物“对苯二胺”，长期使用将导致白血病、皮肤癌、乳腺癌等疾病。对苯二胺是国际公认的一个致癌物质。由于染发剂接触皮肤，而且在染发的过程中还要加热，苯类有机物质通过接触和加热后，通过头皮进入毛细血管，然后随血液循环到达骨髓，如果长期反复作用于造血干细胞，会导致白血病的发生。经常染发的人群乳腺癌、皮肤癌、膀胱癌的发病率都会增加。微核(micronucleus,简称MCN)，也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前，国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。微核检测技术灵敏度高，可靠性强；技术简单，易于操作，而且有显而易见的实用性；实验周期短，且蚕豆根尖细胞周期中大部分时间处于对诱变剂敏感的间期，便于遗传毒性检测试验，精确度也比较高。本实验为染发剂和洗洁精的毒性提供了理论依据，同时引起人们的高度重视，也希望有关部门对日用品中的有害物质含量进行严格控制和检测。2实验部分2.1材料与试剂蚕豆(viciafaba)(为当年生无虫饱满，大小均一蚕豆(Vciafaba)种子，四川

农业大学农学院遗传学实验室提供）6mol/L盐酸，甲醇，醋酸洋红，CrO3,NaN3处理液，甲基磺酸乙酯（EMS），蒸馏水，冰醋酸，卡诺氏固定液，乙酸乙酯显微镜，计数器，镊子，载玻片，盖玻片，烧杯，磁盘，培养箱，分析天平，水浴锅，酒精灯，剪刀，解剖针，滤纸，铅笔，标签纸，胶水等。2.2实验预处理实验流程图:2.3实验步骤2.3.1浸种催芽选择粒大饱满、大小均匀的蚕豆种子按需要量放入盛有自来水的烧杯中，在25°C下浸泡24h,期间至少换水2次。种子吸胀后，用纱布松散后裹置瓷盘中，保持湿度，在25C恒温培养箱中催芽12〜24h，待初生根长2〜3mm，取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的瓷盘中25C继续催芽，经约36〜48h,大部分初生根长至1〜2cm，根毛发育良好，这时即可用于检测了。2.3.2诱变剂处理取染发剂用蒸馏水配置成不同浓度的溶液，浓度为0.25mg.mL-1；称取氧化型染发剂样约0.25g(精确至少数点后四位)于5mL离心管中，加乙酸乙酯(或者分析纯二甲基亚飒(DMSO))定容，混匀，放置离心机(2000r/min)中离心20min，取上层清液稀释到250mL。此溶液含洗发剂0.25mg/mL，取适量体积置于培养皿中用于处理蚕豆根尖。将雕牌洗洁精分别配成0.5mg/mL的溶液100mL,并用稀盐酸调节酸碱度，使pH为7-8。取和染发剂等体积的溶液处理蚕豆根尖。同时用自来水作阴性对照，用0.25mg/L叠氮化钠作阳性对照。当初生根长到2〜3cm时，各选初生根生长良好的蚕豆6〜8粒，分别放入四个培养皿中中，染色24〜27h。2.3.3恢复培养处理后的种子用自来水和蒸馏水共浸洗3〜5次，每次2〜3min，洗净后，再置入铺有湿润滤纸的瓷盘中中，25C恢复培养22〜24h。2.3.4取材、固定 将恢复培养后的种子，从根尖顶端，切下1cm长的幼根。用卡诺氏液固定24h。2.3.5解离、制片观察用蒸馏水浸洗两次，每次5min，吸十，加入6mol/L盐酸将幼根浸没，室温下酸解10min，幼根软化即可。吸取盐酸，用蒸馏水浸洗三次，每次1〜2min，最后浸于水中；取根置于载玻片上，截下1〜2mm长的根尖，滴一滴醋酸洋红染液，染色5〜8min，加盖玻片压片观察。2.3.6微核计数微核是游离于蚕豆根尖细胞浆中圆形或椭圆形小体.其太小不超过主核1/3,染色性与主核相一致。每组随机取3个根尖，高倍镜观察l000个间期细胞，统计徽核数及徽核率，然后用方差分析做统计学处理。结论3.1、实验结果与分析通过镜检后得到的实验数据如下表所示:处理物质0.25mg/mL染发剂溶液0.5mg/mL洗洁精溶液自来水（阴性对照）0.25mol/L叠氮化钠（阳性对照）观察的细胞个数26783278110251596微核数476512337微核率17.55%19.82%11.16%23.18%根据上表中的数据可进一步计算污染指数［污染指数二样品实测微核千分率平均值/对照组（自来水）微核千分率平均值］，染发剂和洗洁精的污染指数分别为1.7、1.8，均在1.5〜2区间，属于轻度污染。另外，本实验中叠氮化钠对蚕豆根尖微核的诱导作用最强，洗洁精、染发剂次之，自来水的诱导作用最弱，而且其微核率偏高。这主要因为现在自来水中加了消毒剂，消毒剂是化学物质，对蚕豆根尖有一定程度的诱导作用使其形成微核。4、综述综上可见，洗洁精毒性不大，只要控制其用量可供日常生活使用；单次使用一定剂量的染发剂染发也不会有很强的毒性，但如果使用频繁，对人体细胞的诱导作用加强，很可能会致癌。本实验通过染发剂、洗洁精对染色体的危害进行了研究，进而推断出其对人体的危害，以引起人们的高度重视，同时也为染发剂的进一步研究提供了依据。参考文献［1］赵跃华.细胞微核技术的研究和应用.生物学通报［N］.1992.1:2］孙立平等.微核实验的自动化检测研究进展［J］.癌变•畸变•突变.2004［3］ 周秀艳等.辽宁典型工业废水生物毒性综合评价［J］.毒理学杂志.2005［4］ 臧宇等.蚕豆根尖微核试验的应用与发展.癌变•畸变•突变［M］.1999宋虹刘明友.蚕豆微核检测技术在制浆造纸废水生物危害性测试上的应用.PaperScience&Technology[M].2006帅素容.诱变物质的微核检测技术.普通遗传学实验教程[M].2003.8刘增禹蔡文国.方便面调料对蚕豆根尖的遗传毒性[J].食品科技.2009刘瑞祥，常惠丽等.微核技术及其在监测水质污染中的应用，晋东南师范专科学校学报.2002,19(5)：25-27[9]陈晓倩.应用蚕豆根尖细胞微核技术检测上海给排水系统中的致突变情况.癌变•畸变•突变，2000,12(4)：214-2l8艾尔肯•热合曼等.用蚕豆根尖细胞微核技术检测乌鲁木齐河水质.干旱环境监测，2000,14(1)：6-l1张国栋等.扬中市地表水的致突变性研究.重庆环境科学，2002,22(3)：58-60徐鑫成等.芦荟和大蒜抗诱发微核效应.癌变•畸变•突变，1999,l1(5)：233-236徐鑫成，李晓萍.细胞微核技术及其应用.科技开发动态.2004,(3)：3-5盖均镒.实验统计方法.北京：中国农业出版社，2005：88-90陈光荣，金波，李明等.污染指数在微核技术监测水质污染中的应用.中国环境科学，1986,6(2):60-63Mosley-Foreman,C,Choi,J;Wang,S;Yu,H.PhototoxicityofphenylenediaminehairdyechemicalsinSalmonellatyphimuriumTA102andhumanskinkeratinocytes.[J].JacksonStateUniversity,Jackson,MS39217,USA.Hu,T,Bailey,RE;Morrall,SW