蛋白质双向电泳

模块五蛋白质双向电泳1.实验目的掌握双向电泳能根据等电点和分子量分离蛋白质的原理，第一向等电聚焦电泳(IEF)和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)操作步骤，掌握凝胶染色方法，掌握凝胶分析软件的使用，了解对分离出的特异蛋白质的进一步分析方法，了解利用电泳技术分析生物大分子的方法。实验原理从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦(载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度)，根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS，根据相对分子质量分离蛋白质。这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。第一向等电聚焦：等电聚焦(isoelectrofocusing，IEF)是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体(ampholyte)的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点(isoeletricpoint，PI)。在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。如果在pH梯度环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质一SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变°SDS使蛋白质分子的二硫键还原，使各种蛋白质一SDS复合物都带上相同密度的负电荷，而且它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的天然的电荷差别。在构象上，蛋白质一SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，这样的蛋白质一SDS复合物，在凝胶中的迁移就不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而仅取决于相对分子质量的大小，从而使我们通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来测定蛋白质的相对分子质量。单体丙烯酰胺和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺，在催化剂存在的条件下，通过自由基引发的聚合交联形成聚丙烯酰胺凝胶，这提供了蛋白质泳动的三维空间凝胶网络。在SDS-PAGE电泳时相对分子质量小的蛋白质迁移速度快，相对分子质量大的蛋白质迁移速度慢，这样样品中的蛋白质可以分开形成蛋白质条带。实验设备垂直电泳仪，水平电泳仪，低温循环水浴，脱色摇床，扫描仪，ImageMaster2Dplatinumversion5.0软件。电泳仪及其配套制胶设备、脱色摇床。

4.实验试剂(1)溶涨液:8mol/LUrea2%CHAPS20mmol/LDTT0.5%或2%IPGbuffer少许漠酚蓝(2)平衡缓冲液储液：50mmol/LTris(pH8.8)6mol/LUrea30%甘油2%SDS少许漠酚蓝(3)单体储液：30%(W/V)丙烯酰胺0.8%(W/V)甲叉双丙烯酰胺(4)分离胶缓冲液：1.5mol/LTris(pH8.8)。(5)浓缩胶缓冲液：1.0mol/LTris(pH6.8)。(6)SDS电泳缓冲液：25mmol/LTris192mmol/L甘氨酸0.1%SDS(7)染色液：0.25%考马斯亮蓝R-25045%甲醇45%水10%冰乙酸(8)脱色液：45%甲醇45%水10%冰乙酸(9)10%SDS(10)10%的过硫酸铵。5.实验方法（1）上样：一般采取加样品溶涨法，取大约30-60gg的蛋白与溶胀液混合，总体积为250gLo蛋白与溶胀液混合物加入胶条槽从酸性端去掉胶条的保护膜蛋白与溶胀液混合物加入胶条槽从酸性端去掉胶条的保护膜放置胶条：胶条酸性端（尖端）朝胶条槽阳极（尖端）方向放入胶条槽，慢慢下压，最后放下胶条碱性端（平端），使溶液浸湿整个胶条，避免生成气泡。在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。将胶条槽平放于IPGphor仪器上，与水平方向垂直，如是多个胶条槽注意相互平行（2）第一向等电聚焦：设置IPGphor仪器的运行参数。工作温度20°C，每胶条最大电流50gA，以下为电压设定情况:

电压（V）升压模式电泳时间电压（V）升压模式电泳时间30Step-n-hold12hr1000Step-n-hold1hr200Step-n-hold1hr8000Gradient3hr500Step-n-hold1hr（3） 一向到二向胶条的平衡：将胶条放入10mL平衡缓冲液I中（含1%DTT）封口，在摇床上振荡15min。将胶条取出放入10mL平衡缓冲液II中（含2.5%碘乙酰胺）封口，在摇床上振荡15min。用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的液体。（4） 灌胶模具的安装：按仪器说明书装好灌胶模具，称之为“三明治”。（5）凝胶浓度确定：根据预分离蛋白质相对分子质量范围确定需配置的凝胶浓度，主要指分离胶浓度。凝胶浓度分离范围（KD）5%36〜2007.5%24〜20010%14〜20012.5%14〜10015%14〜•60一般实验中多采用浓度10%或12.5%的分离胶及浓度为5%的浓缩胶，制胶参照下表。（6）灌注分离胶：按配比配制分离胶，配制完成后即可加入到制作好的制胶模具中，该过程需均匀注入，防止产生气泡，同时动作要迅速。灌注一定量的分离胶后迅速注入水覆盖在凝胶溶液上层，将“三明治”充满。（10）小心拔出梳子，将灌注好的制胶模具放入到盛有（10）小心拔出梳子，将灌注好的制胶模具放入到盛有1XSDS电泳液的电泳槽中，然后在制胶模（7） 分离胶凝结后会形成清晰的胶平面，此时可参照浓缩胶配方配制浓缩胶。（8） 灌注浓缩胶：倒掉覆盖液，注入浓缩胶后立即插入梳子。待浓缩胶凝结后可上样。1。皿皿U1UO0OO（9）将固定制胶模具与底座的凸轮取下，用其将上层电泳槽与凝胶模具连接。按照顺序一次固定好电泳设备。具内注入1XSDS电泳液。H £ ・顼■… inLiki£ft!Ir上槽电泳液为新配制的，约需il|卡 ：ir下槽电泳液可为回收的电泳缓冲液，. 一般需4L。（11）上样：将准备好的样品加入到上样孔中。」」皿皿皿耻000000-b斗T□

（12） 电泳：可选择恒压或恒流方式，通常SDS-PAGE电泳条件为浓缩胶部分为100V,50mA,约30min，分离胶部分为250V，50mA大约需要3hr，电泳温度为15°C。（13） 凝胶的检测：当漠酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳，取下胶放入染色盒中进行染色。考马斯亮蓝染色和脱色：染色液染色4hr，也可染色过夜。加入适量脱色液，可多次更换直到脱色干净为止。硝酸银染色固定：25mL的冰醋酸，100mL甲醇，125mL去离子水，60min。敏化：75mL甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165mL去离子水，30min。清洗：用250mL的去离子水清洗3次每次5min。银染：0.625g硝酸银，250mL去离子水（使用之前配制）。显色：6.25g碳酸钠，100以I的甲醛（使用之前加入），250mL去离子水。终止：5%的醋酸。采集图像，分析结果。（14）双向电泳图谱的分析：双向电泳图谱的分析的一般过程为获取凝胶图象；调整和校准凝胶图匹配凝胶图像；分析、整合数据并报告结果。该步的实验去向，应用软件为匹配凝胶图像；分析、整合数据并报告结果。该步的实验去向，应用软件为ImageMaster2D过程检验、分析蛋白质双向电泳结果，从而决定下Platinumversion5.0。利用扫描仪扫描得到凝胶图像。I导入凝胶图像（图1，2）。I凝胶图像选点（图3,4）。I设置landmark（图5）。I自动匹配（图6，7）。I分析数据（图8）。

-!□!x|o]s]昭i©i-!□!x|o]s]昭i©i园moi眉北|血|罪|H▼〔回|value-IeportonGroups(Wol).FhechosenstatisticsareMean(100^)andM.S.D.GroupIDMean(100%)M.S.DVariationRatio(100%)*Separability930Q6ve-w—3059351.524691.463530.95988826.38132.509063.288983065940.5044340.2661530.52762822.99410.3097720.8859193077010.3000970.3254991.0846521.31800.5463250.2486973087520.2099090.1202730.57297519.43920.1168060.3690133092870.3249010.2945300.90652118.47250.6185080.37031331010140.2664640.1833580.68811516.39680.134749U,1672683117210.1165680.1348581.1569015.67710.3604090.0579932<1注意事项（1） 根据预分离蛋白质的相对分子质量范围确定使用的凝胶的浓度。（2） 凝胶染色方法众多，其主要区别是灵敏度不同，需根据实际需要选择。通常考马斯亮蓝染色能检测到约含量为1以的蛋白质点，硝酸银染色法能检测到含量为ng级的蛋白质点。（3） 离子是等电聚焦过程中比较大的干扰因素，在实验过程中应该尽量避免引入离子。如蛋白质提取方法的确定，使用去离子水等。（4） 如果双向电泳分离的蛋白质点需进行质谱鉴定，那么需要注意选择对质