激发与发射光谱

激发与发射光谱第一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如‘2)。

c.

镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状类似）成镜像对称关系。第二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日吸收谱与激发谱吸收谱

化合物的吸收光强与入射光波长的关系曲线。吸收谱反映出的是物质的基态能级与激发态能级之间所有的允许跃迁。通常状态下的物质的表观颜色大部分时候取决于其吸收特性激发光谱

固定发射波长(一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位),扫描出的化合物的发射光强(荧光/磷光)与入射光波长的关系曲线。激发光谱则反映的是基态与所有与该荧光发射有关的上能级之间的跃迁。其所呈现的关系比吸收谱要有选择性，但有时候有不如吸收谱来的直接。S3S0吸收发射荧光l1l0l

0S2S4S5l4l3第三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日一、荧光光谱与磷光光谱荧光光谱

固定激发光波长(一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位),物质发射的荧光强度与发射光波长关系曲线，如右图中曲线II。荧光本身则是由电子在两能级间不发生自旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。磷光光谱

固定激发光波长(一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位),物质发射的磷光强度与发射光波长关系曲线，如右图中曲线III。磷光本身则是由电子在两能级间发生自旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。第四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫Stokes能级图第五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日0.荧光与磷光的产生过程由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；

基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…

；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…

；第六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日1.电子激发态的多重度

电子激发态的多重度：M=2S+1

S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；

S0→T1禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；

第七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2.镜像规则的解释

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。

第八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日3.激发态→基态的能量传递途径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；第九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日4.非辐射能量传递过程

振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。

内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。

外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。第十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日5.辐射能量传递过程

荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为‘2的荧光；10-7～10-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；‘2>2>1；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）

S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持续一段时间。第十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱第十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日二、荧光的产生与分子结构的关系1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；第十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。第十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日三、影响荧光强度的因素

影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；第十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日4.内滤光作用和自吸现象

自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；第十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日5.溶液荧光的猝灭碰撞猝灭；氧的熄灭作用等。第十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日红外荧光——红外荧光的特点及应用第二十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日所内红外荧光领域的研究分布近红外激光晶体稀土离子掺杂的激光晶体过渡族离子掺杂的激光晶体红外荧光探针过渡金属配合物第二十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日稀土离子掺杂的激光晶体第二十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日稀土离子能级简图第二十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日荷兰的R.T.Wegh等利用德国DESY同步辐射装置对稀土离子VUV波段的激发谱做了细致研究，并对比理论计算对VUV谱区4f能级的预测，成功地将Dieke图扩展到了70000cm-1的能量范围。他们选择高纯LiYF4作为稀土掺杂的基质，因为在这种氟化物晶格中，有可能与稀土离子高能区的4fn能级相互干扰的4fn-15d和电荷迁移态（CTS）能级都处于尽可能高的能区，故与4fn能级易于区分开来，更便于理论与实验上对能级的指认研究。

扩展Dieke图第二十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第二十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第二十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第二十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第二十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日荧光图例第二十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Nd3+第三十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Nd3+第三十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Yb3+第三十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Yb3+第三十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Er3+第三十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Er3+第三十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Pr3+第三十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Pr3+第三十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Tm3+第三十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Tm3+第三十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Ho3+第四十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Eu3+第四十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Sm3+第四十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日Tb3+第四十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日过渡族离子掺杂的激光晶体第四十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第四十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第四十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日荧光图例第四十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日相关参考第四十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日过渡金属配合物第四十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日过渡金属配合物荧光探针过渡金属配合物的特点很多过渡族金属与配体配合时能够形成新的能级结构（HOMO/LUMO），基态与这些能级的跃迁往往被归结为MLCT或LMCT。这种新的跃迁机制，较容易导致量子产率相对于配体的显著增强，同时可以通过改变配位中心或配体结构在很宽的波段内调控其发射波段，所以从几十年前就开始研究了。第五十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日过渡金属配合物荧光探针应用参考在其在生命科学中的应用方面位于Maryland的CFS作了诸多工作。综述EmergingBiomedicalApplicationsofTime-ResolvedFluorescenceSpectroscopy.Lakowicz,J.R.(1994)In:TopicsinFluorescenceSpectroscopy,Vol.4:ProbeDesignandChemicalSensing(J.R.Lakowicz,Ed.),PlenumPress,1-19.RecentDevelopmentsinFluorescenceSpectroscopy(1996).Lakowicz,J.R.,Terpetschnig,E.,Szmacinski,H.,Malak,H.,Kusba,J.andGryczynski,I.,.In:AnalyticalUseofFluorescentProbesinOncology.(Kohen,E.,andHirschberg,J.G.,Eds.),PlenumPress,NewYork.pp.65-79.Long-LifetimeMetal-LigandComplexesasProbesinBiophysicsandClinicalChemistry(1997).Terpetschnig,E.,Szmacinski,H.,andLakowicz,J.R.In:MethodsinEnzymology,Vol.278.AcademicPress,pp.295-321.RecentDevelopmentsinFluorescenceSpectroscopy.Long-LivedMetal-LigandProbes,Three-PhotonExcitation,Two-ColorTwo-PhotonExcitationandOpticalControlofExcitedStatePopulation.Lakowicz,J.R.,Gryczynski,I.,andSzmacinski,H.(1998).FluorescenceMicroscopyandFluorescentProbes,Vol.2(J.Slavik,Ed.),PlenumPress,NewYork,pp.1-12.应用进展Long-lifetimeLipidRheniumMetal-LigandComplexforProbingMembraneDynamicsontheMicrosecondTimescale.Li,L.,Castellano,F.N.,Gryczynski,I.,andLakowicz,J.R.(1999).Chem.PhysicsLipids99:1-9.

SynthesisandCharacterizationofaSulfhydryl-ReactiveRheniumMetal-LigandComplex.Dattelbaum,J.D.,Abugo,O.O.,andLakowicz,J.R.(2000).BioconjugateChem.11:533-536.

SpectralPropertiesofFluorophoresCombiningtheBoronicAcidGroupwithElectronDonororWithdrawingGroups.ImplicationintheDevelopmentofFluorescenceProbesforSaccharides,N.DiCesareandJ.R.Lakowicz(2001).J.Phys.Chem.A.,105(28):6834-6840.

第五十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日过渡金属配合物荧光探针前景过渡金属配合物很多能实现较强的红外波段宽带发射，可以有效避开组织体的吸收，可以穿透组织体实现红外成像，克服同位素原子示踪对人体的伤害；寿命处于us量级，可以用于较大分子的形变和转动扩散研究，当然，结合其特有的发射波段也能对活体环境中的许多扩散和转变过程进行研究。第五十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第五十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日过渡金属配合物图例第五十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日荧光探针细胞活性探针细胞活性和细胞毒性试剂盒活细胞探针死细胞探针测定活细胞中巯基和谷光甘肽的探针膜荧光探针膜流动性荧光探针荧光基团标记的磷脂阴离子型膜探针阳离子型膜探针中性膜探针细胞器探针线粒体探针溶酶体探针内质问探针高尔基复合体探针位点特异性荧光探针受体特异性荧光探针细胞骨架探针研究钙调节及活性的荧光探针核酸荧光探针第五十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日荧光探针胞内离子探针钙离子探针胞内pH值荧光探针其他离子探针电位敏感性探针快响应探针慢响应探针笼锁化合物探针底物荧光探针核昔酸拟生物及寡核昔吱荧光探针LacZ基因表达的底物荧光探针GM基因表达的底物荧光探针Luc基因表达的底物荧光探针脱辅水母蛋白基因表达的底物荧光探针氯霉素乙酰转移酶(cAT)的底物荧光探针HIv蛋白酶的底物荧光探针人肾素底物荧光探针第五十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日稀土元素探针稀土离子也是一类核酸探针的检测试剂。在水溶液中仅有Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)发出荧光，与DNA配合后仍保留荧光性能，可特异识别核苷酸。Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)与一些小分子配体配合，由于配体本身性质、中心离子-配体成键及溶剂等因素影响，使配合物的激发态寿命达到ms级，并发出窄而强的荧光。Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)与小分子的配合物探针通过共价键与靶DNA共价结合后多用于实时定量荧光PCR反应产物的分析及杂交测试。该类探针要求稀土配合物易于合成并且足够稳定，同时荧光发射强度大。Nurmi等用Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)标记的探针进行实时同步扩增及前列腺特异抗原的测定，信噪比要高于传统的TaqMan探针，而循环阈值则降低。第五十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日量子点荧光探针量子点荧光探针是由Ⅱ-Ⅳ族和Ⅲ-Ⅴ族元素组成的半导体纳米颗粒，将核酸连接到量子点的表面，做成探针，通过体外杂交常规荧光(FISH)分析，发现染色体的异常及变异，可取代一些有机荧光染料进行生物分子检测。研究较多的有CdSe、CdTe、ZnS等。量子点探针可以在有机溶剂中制备，但须经过一定的化学修饰，使其表面具有一定的水溶性基团，同时又具备一些与生物分子偶连的活性基团，因而反应条件苛刻，步骤复杂，成本较高。尽管在水溶液中制备的成本低，但量子点的荧光产率低，尺寸分布较大。目前较多采用在有机溶剂中合成。在强激光下易发生光漂白，是有机类荧光染料最普遍的缺陷。量子点探针较传统的有机荧光染料具有一定的优越性。首先，荧光光谱范围宽，通过改变纳米晶体材料和尺寸，获得的激光诱导荧光光谱范围在400nm～2µm；其次，荧光光谱范围可调，稳定性好，荧光寿命长，且可用单一波长的激发光源同时激发不同大小尺寸的量子点，得到不同荧光发射波长的检测信号，相对于有机荧光染料的单一光源激发得到单一荧光发射信号，降低了实验成本并简化了分析步骤。1998年，Bruchez等[44]制备了CdSe-ZnS核-壳结构的纳米晶体，之后又增加了SiO2层，使其具有水溶性，同时SiO2经过修饰后可以与生物分子结合，量子产率高且稳定。Nie等将量子点的表面连接上巯基乙酸，使量子点不仅具有水溶性，同时可与