染色体微阵列的原理与临床应用

染色体微阵列的原理与临床应用第一页，共七十二页，编辑于2023年，星期日一.出生缺陷概念及概况二.遗传病常见诊断方法及比较三.染色体微阵列技术临床应用四.病例分享五.染色体微阵列技术局限性、结果判读及带来的挑战第二页，共七十二页，编辑于2023年，星期日一.出生缺陷概念及概况第三页，共七十二页，编辑于2023年，星期日出生缺陷也称先天异常，是指由于遗传因素、环境因素或两者共同作用于孕前或孕期，引起胚胎或胎儿在发育过程中发生解剖学结构和/或功能上的异常。2012年卫生部统计我国出生缺陷率达5.6%，每年新增出生缺陷患儿90-120万例。随着二胎政策的全面放开，孕妇年龄增加及环境因素影响，估计出生缺陷数量还会增加。保守估计，我国有上千万的罕见病群体，几乎无法得到有效诊断和治疗，甚至遭到严重歧视。第四页，共七十二页，编辑于2023年，星期日出生缺陷出生缺陷遗传因素环境因素（理、化、生物因素、生活方式）遗传+环境因素染色体异常（所有新生儿中，染色体异常占0.92%，多为新发而非遗传）单基因突变（多为孟德尔遗传，少数为新发）第五页，共七十二页，编辑于2023年，星期日基因组：细胞核DNA成分和线粒体DNA分子的总和基因:基因组内一个个具体的结构和功能单位染色体：基因的载体细胞核DNA:46条染色体，30亿个碱基，编码21000个基因。线粒体DNA:双链闭合环状分子，16569个碱基，编码37个基因，编码2种rRNA、22种tRNA和13种氧化磷酸化相关蛋白。第六页，共七十二页，编辑于2023年，星期日第七页，共七十二页，编辑于2023年，星期日第八页，共七十二页，编辑于2023年，星期日第九页，共七十二页，编辑于2023年，星期日Progeriasyndrome

ApointmutationoftheLMNAgenelongevityMorethan150genespreventscholesterolbuildup第十页，共七十二页，编辑于2023年，星期日

精确控制胚胎发育和分化的每一个步骤;决定了个体的所有生命特征;决定了个体患各种疾病的可能性.第十一页，共七十二页，编辑于2023年，星期日遗传病：遗传物质发生突变所引起的疾病。种类：确定的遗传疾病超过7000种。1、单基因病--涉及一对基因，AR、AD、XR、XD、Y连锁遗传病。隐性遗传4000，显性遗传3000。

2、多基因病--多对基因和环境共同作用所导致的疾病。

3、染色体病--数目异常及结构异常引起的疾病。4、体细胞遗传病--体细胞突变如肿瘤。5、线粒体病--线粒体功能异常为主要起因的一大类疾病。特征：垂直传递、终生性、发病率低、危害严重、家族性发病、多无有效治疗。成为危害人类健康的主要疾病。遗传病第十二页，共七十二页，编辑于2023年，星期日Genetic/GenomicDisordersGenomicdisorders(number)Trisomy21Trisomy18Trisomy13MosaictrisomiesofotherchromosomesGenomicdisorders(structure)Morethan400knowndisordersMonogenicdisordersDominant(4,000)Recessive(3,000)MultigenicdisordersGenes+Environments第十三页，共七十二页，编辑于2023年，星期日二.遗传病常见诊断方法及比较第十四页，共七十二页，编辑于2023年，星期日遗传病的诊断染色体核型分析Karyotyping荧光原位杂交

FluorescenceInSituHybridization(FISH)染色体微阵列技术Chromosomalmicroarrayanalysis(CMA)

测序技术First-generation-SangermethodNovelsequencingtechniques第十五页，共七十二页，编辑于2023年，星期日传统核型分析技术除了染色体非整倍体，染色体微缺失和微重复等基因组失衡是导致胎儿发育迟缓、畸形和其他先天性疾病的主要原因。Structuralvariationinthehumangenomeanditsroleindisease[J].AnnuRevMed.2010,61:437-55第十六页，共七十二页，编辑于2023年，星期日第十七页，共七十二页，编辑于2023年，星期日是目前较为成熟的遗传性疾病诊断技术传统核型分析技术绒毛活检取材孕中期羊膜腔穿刺羊水细胞培养染色体核型分析染色体数量变化、平衡、不平衡易位、转位和显微镜下可见的大片段缺失和重复。

第十八页，共七十二页，编辑于2023年，星期日核型分析局限性材料受限，需要新鲜的组织、血样进行活细胞培养不能分辨长度在10Mb以下染色体片断的缺失、重复或易位染色体亚端粒区域异常诊断率较低不能检测LOH和UPD单细胞分析

高分辨率分析第十九页，共七十二页，编辑于2023年，星期日荧光原位杂交技术（fluorescentin-situhybridization，FISH)可对相应位点的缺失、重复、易位及多倍体等染色体异常作出诊断提高了染色体异常的诊断精度FISH探针能同时与分裂期染色体或间期核染色丝特异杂交----无需细胞培养，可用于单细胞分析Chromosome13q13-14荧光标记的DNA探针中期分裂相间期细胞核Chromosome21q21第二十页，共七十二页，编辑于2023年，星期日FISH局限性只能检测已知突变的疾病，对背景未知的基因引发的疾病无法检测。不能分辨LOH和UPD一次最多只能检测5-8个位点，无法进行整个基因组的检测，增加探针又会面临准确性下降的问题。对植入前胚胎的检测，缺乏覆盖全基因组检测的能力第二十一页，共七十二页，编辑于2023年，星期日染色体微阵列技术（chromosomalmicroarrayanalysis）微阵列比较基因组杂交(arraycomparativegenomichybridization,aCGH)SNParray第二十二页，共七十二页，编辑于2023年，星期日微阵列比较基因组杂交技术

(arraycomparativegenomichybridization,aCGH)

aCGH技术图示：正常对照样品和患者样品基因组DNA用两种不同的荧光染料进行标记（正常样品用Cy3标记呈现绿色，患者样品用Cy5标记呈现红色）。绿色峰（Cy3）表明红色信号缺失，与对照样品相比患者DNA样品发生缺失。相反如果Cy5信号增强显示为红色峰（红色箭头），表明患者DNA样品特定基因组区域发生获得。aCGH芯片能够定位DNA拷贝数量变化在基因组的位置。第二十三页，共七十二页，编辑于2023年，星期日SNP芯片含有大量寡核苷酸探针，起初设计被用于检测SNP等位基因。SNP芯片不仅能够研究拷贝数变异（CNV），而且还能够对SNP基因型进行分析SNParray第二十四页，共七十二页，编辑于2023年，星期日染色体微阵列(chromosomalmicroarrayanalysis,CMA)技术优势全基因组范围内同时检测染色体数目异常和结构异常如染色体微缺失(deletion)和微重复(duplication)，并能较准确的测定其大小，并精确定位。不需要细胞培养，可直接检测血液、羊水(amnioticfluid,AF)和绒毛膜绒毛(chorionicvillussampling,CVS)样本，出报告速度更快，结果更加准确可靠。检测≥10%水平的嵌合体鉴定杂合子缺失LOH和单亲二倍体(uniparentaldisomy，UPD)，亲缘关系的分析。分辨率高：30Kb结合全基因扩增技术，可以进行胚胎全染色体组的检测------PGS/PGD第二十五页，共七十二页，编辑于2023年，星期日自身局限性：不能检测染色体平衡易位(相互易位、罗伯逊易位、倒位、平衡插入）不能检测点突变及串联重复序列扩增导致的遗传病(如脆性X染色体综合征）不能检测到低于本平台检测下限的基因组不平衡现象不能检测三倍体以上的多倍体会检测出临床意义不明拷贝数变异(copynumbervariants,CNVs)。第二十六页，共七十二页，编辑于2023年，星期日CMA基因芯片染色体核型分析FISH检测范围整套染色体数目异常和微缺失、微重复结构异常整套染色体数目异常，大片段缺失、重复，平衡及不平衡易位，倒位靶向检测细胞培养不需要需要两者均可单亲二倍体YesNoNo近亲结婚YesNoNo分辨率30Kb5-10Mb100Kb嵌合体YesYesYes染色体芯片与传统细胞遗传学技术比较第二十七页，共七十二页，编辑于2023年，星期日染色体微缺失和微重复综合征概念：染色体微阵列技术（chromosomalmicroarrayanalysis，CMA）和荧光原位杂交技术（florescenceinsituhybridization，FISH）的应用，使许多用传统染色体核型分析难以识别的染色体综合征得以发现。这些综合征缺失和重复的大小多在几百Kb到几兆碱基对。与单基因病不同，其症状受多基因影响，因而又称连续性基因缺失或重复综合征(contiguousgenedeletionorduplicationsyndrome）。大部分综合征不能被染色体核型分析所识别，因而成为微缺失和微重复综合征(microdeletionandmicroduplicationsyndrome）。

第二十八页，共七十二页，编辑于2023年，星期日拷贝数变异(copynumbervariants,CNVs)：

指大于1kb染色体变异(基因组变异)，包括核型分析检测不到的基因组微缺失和微重复，被发现广泛存在于人类基因组中。已有大量研究证实CNVs与许多疾病相关，包括数百种染色体微缺失、微重复综合征，是先天畸形和神经发育障碍的主要遗传病因，包括智力低下(mentalretardation,MR)，自闭症(autism),精神分裂症(Schizophrenia)等。第二十九页，共七十二页，编辑于2023年，星期日三、染色体微阵列技术

临床应用第三十页，共七十二页，编辑于2023年，星期日出生缺陷干预----关注生殖全程染色体异常产前诊断孕前诊断精子产后先天性疾病诊断卵子+胚胎胎儿新生儿、儿童早期诊断早期干预改善预后夫妻双方检测正常再次生育再发风险低致病片段携带再次生育再发风险高第三十一页，共七十二页，编辑于2023年，星期日染色体微阵列技术临床应用植入前遗传病筛查和植入前遗传病诊断(PGD/PGS)产前诊断产后遗传病诊断反复习惯性自然流产病因分析第三十二页，共七十二页，编辑于2023年，星期日对植入前胚胎或卵裂球作染色体和/或基因学检测，将无疾病胚胎植入子宫妊娠，并出生正常子代的技术辅助生殖与遗传学技术相结合的一种产前诊断方法关键点是建立单细胞遗传诊断技术孕前诊断-----植入前遗传学诊断技术

(preimplantationGeneticDiagnosis,PGD)第三十三页，共七十二页，编辑于2023年，星期日高龄产妇反复体外受精失败反复流产严重的男性不育症父母为平衡易位、倒位携带者非整倍体是辅助生殖低妊娠率和高流产率的主要因素，PGS的目的是识别整倍体的正常胚胎转移，以实现增加怀孕的机会CMA植入前胚胎遗传学筛查/诊断适应人群1in10couples第三十四页，共七十二页，编辑于2023年，星期日第三十五页，共七十二页，编辑于2023年，星期日CMA产前诊断适应人群父母为平衡易位携带者胎儿B超检查发现异常羊水染色体核型分析已发现异常，但无法确定异常染色体的确切位置或来源胎儿发现新发的染色体相互易位，需进一步排除微缺失和微重复希望更全面、更准确的了解胎儿染色体情况，以排除出生缺陷的可能性（生长发育迟缓，智力低下、自闭症等原因）产前诊断第三十六页，共七十二页，编辑于2023年，星期日产前诊断第三十七页，共七十二页，编辑于2023年，星期日用于检测CNV的染色体芯片（CMA)在下列情况应作为一线检测手段非已知综合症的多发畸形非综合症型的发育迟缓/智力低下孤独症谱系疾病进一步明确发育迟缓、语言发育落后和其他尚不明确遗传学病因的症状对于一些CMA检出不平衡的病例，建议用细胞遗传/FISH进行确认，同时对父母进行临床遗传评估和咨询产后出生缺陷患儿遗传病诊断第三十八页，共七十二页，编辑于2023年，星期日TheAmericanJournalofHumanGenetics86,749–764,May14,2010发育障碍和智力低下等先天缺陷疾病首选CMA产后出生缺陷患儿遗传病诊断21698例不明原因发育迟缓、低智，孤独症，多发畸形芯片（CMA)检测：诊断率15%-20%核型分析：诊断率仅3%

第三十九页，共七十二页，编辑于2023年，星期日金域检验（2013-2016）：4750例，26.3%截止2016年5月，金域检验已采用CMA检测出生缺陷/遗传病病例4750例，其中阳性病例1249例，检出阳性率达26.3%患者临床表型智力低下、发育迟缓、多发畸形、自闭症第四十页，共七十二页，编辑于2023年，星期日第四十一页，共七十二页，编辑于2023年，星期日患者临床表型解析临床表型例数阳性率智力低下16916.0%发育迟缓29625.0%多发畸形11626.7%自闭症1237.3%癫痫1277.9%两个系统的异常52329.1%三个或以上系统的异常64633.9%智力低下、发育迟缓、多发畸形等为CMA主要适应症；合并不同临床表型病例，CMA诊断阳性率较高；第四十二页，共七十二页，编辑于2023年，星期日CMA检出CNV类型分析CMA可检出微缺失/微重复、单亲二倍体、非整倍体、嵌合体等多种CNV类型CNV片段大于5MB（核型分析检测下限）:理想情况下核型检出率为4.95%，远低于CMA26.1%的检出率。第四十三页，共七十二页，编辑于2023年，星期日检出微缺失/微重复综合征举例第四十四页，共七十二页，编辑于2023年，星期日微缺失/微重复类型检测出最常见染色体522例阳性样本中所检测出的UPD类型及疾病相关性第四十五页，共七十二页，编辑于2023年，星期日患者双亲评估十分必要为降低患者父母再生育风险，对于患者父母进行相关检测，可有效指导其再次生育。由于CMA不能检测染色体平衡易位，故核型分析和FISH技术在某些特定情况下仍具有优势。部分染色体微缺失/微重复阳性样本按其遗传方式分类第四十六页，共七十二页，编辑于2023年，星期日小结CMA对于智力低下、发育迟缓、多发畸形等多种临床异常可有效诊断，明显优于染色体核型分析，可取代其作为遗传病诊断的一线检测手段；对于患者双亲后续遗传学检测及分析，要选择合适的方法学，做好遗传咨询工作，对再次生育做指导。第四十七页，共七十二页，编辑于2023年，星期日第四十八页，共七十二页，编辑于2023年，星期日染色体异常是导致流产的重要病因

约10%~15%妊娠会发生自然流产，其中绝大多数发生在孕早期，且50%左右是由于染色体异常所致。包括染色体数目异常占86%(包括非整倍体和多倍体)，结构异常(染色体缺失和/或重复)占6%，嵌合体占8%。（以往文献报道）染色体芯片对流产物检测第四十九页，共七十二页，编辑于2023年，星期日目前流产物检测常用手段为核型分析与荧光原位杂交(fluorescentinsituhybridization,FISH)。核型分析：5Mb以上遗传物质改变，无法对许多具有致病性的染色体亚显微结构的变异--染色体微缺失/微重复做出检测。此外需对绒毛组织进行细胞培养，耗时较长，且容易污染。一些活性差的细胞生长受到抑制，或者母体细胞过度生长，这都会导致得不到准确核型。而临床上部分流产物已不具有细胞活性，导致培养失败。FISH检测：可避免细胞培养，然而仅能对特异染色体数目异常进行筛查，常用探针为13、16、18、21、22、X、Y探针，无法对与特异探针结合的其它染色体数目异常进行检测，因此存在假阴性的可能。CMA：可在全基因组范围内同时检测染色体数目异常和染色体微缺失、微重复等结构异常、嵌合体和ROHs等，无需细胞培养，实验周期短，结果更加准确可靠第五十页，共七十二页，编辑于2023年，星期日第五十一页，共七十二页，编辑于2023年，星期日非整倍体中16三体所占比例最高(20.5%)，且均在孕早期流产。其次为Turner综合征(14.5%)，流产可发生孕期各阶段。绝大多数染色体非整倍体为新生突变，而D组(13,14,15)和G组(21,22)有发生罗伯逊易位的可能，建议夫妻双方做核型分析，排除罗伯逊易位的可能性。孕妇年龄为发生染色体数目异常高危因素，而本文小于35岁发生染色体数目异常导致流产占24.6%由于染色体结构异常导致流产81.25%为反复习惯性流产，提示

夫妻双方是平衡易位(75%)，建议再次生育做PGD。染色体内部微缺失/微重复例如DiGeorge、Williams、Beckwith-Wiedemann等综合征流产发生在孕晚期，核型分析

无法检测。UPD第五十二页，共七十二页，编辑于2023年，星期日小结CMA能够提供快速、准确的流产物全基因组分析，能够检测染色体数目异常、结构异常、嵌合体和ROHs等，且无需标本培养，能提供比传统的细胞遗传学检测更多的遗传信息，可为流产病因分析和对夫妻双方再次生育指导提供更有价值的信息。指导下一次妊娠减轻患者不必要的心理负担。第五十三页，共七十二页，编辑于2023年，星期日检测标本活检的单个卵裂球绒毛引产胎儿组织羊水脐血外周血第五十四页，共七十二页，编辑于2023年，星期日四.病例分享第五十五页，共七十二页，编辑于2023年，星期日第五十六页，共七十二页，编辑于2023年，星期日AssociationofCNVwithobesity第五十七页，共七十二页，编辑于2023年，星期日AssociationofCNVwithobesity第五十八页，共七十二页，编辑于2023年，星期日AssociationofCNVwithepilepsy第五十九页，共七十二页，编辑于2023年，星期日第六十页，共七十二页，编辑于2023年，星期日癫痫神经、精神系统疾病，例如ADHD,精神分裂症肥胖、矮小先天性心脏病过度生长综合征CMA出生缺陷检测适应症智力低下生长、运动、语言发育迟缓多发畸形自闭症谱系疾病主要适应症拓展适应症第六十一页，共七十二页，编辑于2023年，星期日出生缺陷患儿检测流程第六十二页，共七十二页，编辑于2023年，星期日GenotypefirstvsPhenotypefirstWholegenomescreeningvsCandidateapproachGrafWD,LePichonJB,BittelDC,AbdelmoityAT,andYuS.Practiceparameter:evaluationofthechildwithmicrocephaly(anevidence-basedreview):reportofthequalitystandardssubcommitteeoftheAmericanAcademyofNeurologyandthePracticeCommitteeoftheChildNeurologySociety.Neurology.2010;74(13):1080-1.LedbetterDH.Cytogenetictechnology--genotypeandphenotype.NEnglJMed.2008;359(16):1728-30.BejjaniBAandShafferLG.Clinicalutilityofcontemporarymolecularcytogenetics.AnnuRevGenomicsHumGenet.2008;9:71-86.63第六十三页，共七十二页，编辑于2023年，星期日五.染色体微阵列技术局限性、结果判读及带来的挑战第六十四页，共七十二页，编辑于2023年，星期日自身局限性：不能检测染色体平衡易位(相互易位、罗伯逊易位、倒位、平衡插入）不能检测点突变及串联重复序列扩增导致的遗传病(如脆性X染色体综合征）不能检测到低于本平台检测下限的基因组不平衡现象不能检测三倍体以上的多倍体会检测出临床意义不明CNV。第六十五页，共七十二页，编辑于2023年，星期日由于CMA不能检测染色体平衡易位，故染色体核型分析和FISH技术在某些特定情况下具有优势。染色体末端发生缺失或重复染色体末端同时发生缺失和重复单亲二倍体：染色体D,G组非整倍体情况：染色体D,G组染色体内部发生缺失和（或