基因控制生物的性状(完整资料)

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人教版八年级(下）基因控制生物的性状(完整资料）(可以直接使用，可编辑优秀版资料，欢迎下载）第七单元生物圈中生命的延续和发展第二章生物的遗传和变异第一节基因控制生物的性状教学目标:知识目标：理解遗传和变异的概念。举例说出生物的性状,以及亲子代间在性状上的延续现象。举例说出不同种性状和相对性状之间的区别。举例说出生物的性状是由基因控制的.能力目标:能够正确判断出所给的两个或多个性状是否互为相对性状.情感态度价值观：关注转基因技术给人类带来的影响。教学重点:性状及相对性状的判断。明确基因与性状间的关系。教学难点：相对性状的判断.教学过程：教学内容教师的教学行为学生行为新课导入遗传与变异的概念展示小猫一家的图片,提出问题：1、猫妈妈和小猫们像吗？２、它们完全一样吗？3、你和自己的父母相比有哪些相同点和不同点呢？思考后回答问题，明确:遗传是亲子间的相似性。变异指亲子间和子代个体间的差异。性状同学们，我们已经知道了人类对遗传和变异的认识,是从性状开始的，那什么是生物的性状呢？接下来就让我们一起来看一看什么是性状。植物中,豌豆的形状、番茄的颜色，以及豌豆茎的高度，这些都是性状。当然，性状同样存在于动物个体中.比如兔子的毛色、公鸡鸡冠的形状等。那么,请大家想一想：1、人的身上有哪些性状?2、你能总结出生物性状的概念吗?同学们回答的非常好。除了书上已经列出的四种人类的性状外，人的AＢＯ血型以及酒窝也属于性状。想一想,是不是所有的性状都能直接用眼睛看到呢？我们可以总结出性状的概念：性状是对生物体形态结构、生理生化和行为方式等特征的总称。我们刚刚看到的那些例子中：血型属于生理生化；能否把舌由两侧向中央卷曲及大拇指能否向背侧弯曲属于行为方式；其他均属于形态结构。展示一张图片,请学生同桌间相互说一说自己能找到或是能联想到哪些性状.学生分小组讨论，结束后选两个小组的代表回答：人的性状有:有耳垂、无耳垂；单眼皮、双眼皮；能否把舌由两侧向中央卷曲;能否使大拇指向背侧弯曲。性状就是生物的外观/样子／特征。不能明确性状的概念。相对性状的概念及判断接下来请大家想一想：在刚才我们见到的那些性状中，每一对中的性状有什么相同点和不同点呢?提示：第一组的性状都是豌豆粒的形状，不过它们有的是圆粒，有的是皱粒;同样是兔子的毛色,有白也有黑。很好，我们能够很容易的看出，每一组都是同一物种的同一性状,但是表现形式不同。我们把同一性状的不同表现形式称为相对性状。这里需要注意:相对，就表示至少要有两个或两个以上才能是相对。如果没有对比是不能称其为“相对”性状的。回答问题：每一组都是同一个性状，但是表现不一样。明确相对性状的概念，并能够判断任意两个性状是否为相对性状。下面我们来做一个小练习，请大家判断以下几组性状是相对性状吗？讲解,对于易错点进行讲解.提出问题：那么，是什么原因产生了不同的性状呢？完成PＰT上的练习题。基因控制性状讲述转基因小鼠的产生过程，请学生分组讨论:1、在这项研究中,被研究的性状是什么？2、转基因超级鼠的获得,说明性状和基因之间是什么关系？３、由此推论，在生物传种接代的过程中，传下去的是性状还是控制性状的基因？小组讨论回答问题。明确生物的性状是由基因控制的。环境与性状的关系在学生已经知道了基因控制性状后，提出问题:是不是只有基因能影响生物的性状呢？教师展示事例.观察同种植物的同一性状在不同环境下不同的表现。明白环境能够影响生物的性状。生物的性状是由基因和环境共同作用的。正确看待转基因除了转基因小鼠外,你还知道那些转基因产物？目前对于转基因的说法有很多，那么你认为转基因安全吗？展示社会各方对转基因食品安全的看法，引导学生正确看待转基因.学生通过提前查阅资料回答.学生分成两组，对转基因的安全性进行辩论。巩固练习完成练习、布置作业。完成习题板书设计：基因控制生物的性状基因控制生物的性状形态性状生理行为{同一性状相对性状表现不同2个/多个{环境+基因=性状课后反思:《基因工程及其应用》教案【教学目标】知识目标掌握基因工程的概念、原理;基因操作的工具及其操作过程.能力目标培养学生分析、推理、归纳、总结的能力。德育目标培养学生实事求是的科学态度从现象到本质的科学的研究方法。【教学重点】基因工程的基本原理，基因操作的工具，基本步骤及其应用.【教学难点】基因工程的基本原理,基因工程的应用及其安全性。【课时安排】1课时【教学过程】一、情境创设提问:各种生物间的性状千差万别这是为什么呢?引导:生物体的不同性状是通过基因特异性表达而形成的.列举：几种生物的不同性状：够吐出丝;豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮气；青霉菌能产生对人类有用的抗生素——青霉素.提问:人类能不能改造性状?能不能使本身没有某个性状的生物具有某个特定性状呢？引导：让禾本科植物能够固定空气中的氮气;能否让细菌“吐出”蚕丝；让微生物生产出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物。(这种设想能实现吗？)定向改造生物的新技术——基因工程。二、师生互动（1）基因工程的原理指导学生阅读教材P102页第二段,通过提问的方式指导学生找出概念中的关键词语，并让学生理解基因工程概念,引导学生独立完成。最后归纳列表，便于学生的记忆.概念：在生物体外,通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合,然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物.（2）基因操作的工具利用多媒体课件演示抗虫棉培育过程示意图,同时提出讨论问题,进行分组讨论,最后交流讨论结果,教师进行归纳总结。思考：在以上的基因工程培育的过程中,关键步骤或难点是什么?引导：关键步骤的完成过程中都要用到基因操作工具,并使学生形象地记忆“工具”的作用。A基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）。通过演示多媒体动画,将限制酶的作用过程进行动态演示，使学生理解抽象的知识内容。

①存在：主要是存在于微生物细胞中。②特性:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定的切点切割DNA分子。③作用结果：得到具有黏性末端或平末端的DNＡ片段,如大肠杆菌中的EcoＲI，能够专一识别GＡATTＣ的序列,并在G和Ａ之间将这段序列切开.Ｂ基因的针线——DNA连接酶从DNＡ的结构入手,利用多媒体动画演示连接酶的连接部位，利用形象的比喻使学生更容易接受和理解.DNA连接酶的作用是在DNA分子的连接过程中，黏合脱氧核糖和磷酸之间的缺口，即将由同一种限制酶切割后的黏性末端（碱基互补）的脱氧核糖和磷酸连接起来。C基困的运输工具——运载体对于运载体的教学，应使学生形象地理解运载体的作用、种类及其所具备的条件。目前常用的运载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等。其中,质粒存在于细菌及酵母菌等生物中,是拟核或细胞核外能够自我复制的很小的环状DＮA分子。学习完这些操作工具后,再来看看现有的基因工程的成果,大家一起思考下这些工具到底怎样操作才能完成基因工程的过程呢？归纳:请学生写出基因工程操作的基本步骤和操作过程。总结：基本步骤：剪切→拼接→导入→表达操作过程：提取目的基因→目的基因与运载体结合→目的基因导入受体→目的基因检测与鉴定(3）基因工程的应用。①基因工程与作物育种作物育种：人们利用基因工程的方法获得了转基因抗虫棉，耐贮存的番茄，耐盐碱的棉花,抗除草剂的玉米、油菜、大豆等.抗虫基因作物的使用，不仅减少了农药的用量，大大降低了生产成本，而且还减少了农药对环境的污染。②基因工程与药物研制利用基因工程生产的药物有胰岛素、干扰素、白细胞介素、溶血栓剂、凝血因子,以及预防乙肝、霍乱、伤寒、疟疾的疫苗等.基因工程生产药品的优点是效率高、成本低、品质好。③转基因生物和转基因食品的安全性转基因生物和转基因食品的优点:解决粮食短缺问题;减少农药使用,从而减少环境污染；节省生产成本，降低粮食售价；增加粮食营养，提高附加价值;增加食物种类,提升食物品质；促进生产效率,带动相关产业发展。转基因生物和转基因食品的缺点：可能产生新毒素和新过敏原，可能产生抗除草剂的杂草，可能使疾病的散播跨越物种障碍，可能威胁其他生物的生存，可能干扰生态系统的稳定性。三、板书设计一、基因工程的原理基因工程的别名操作对象操作水平原理操作环境结果（目的）基因拼接技术或DNA重组技术基因DNＡ分子水平基因重组生物体外定向地改造生物的遗传性状二、基因操作的工具1基因的剪刀—-限制性内切酶(简称限制酶）。２基因的针线—-ＤNA连接酶3基困的运输工具——运载体三、基因工程的应用四、课堂总结及布置作业复习基因工程操作的基本步骤和重要工具，完成课后习题第2节基因在染色体上课程目标１、说出基因位于染色体上的理论假说和实验证据.２、运用有关基因和染色体的知识阐明孟德尔遗传规律的实质。3、尝试运用类比推理的方法,解释基因位于染色体上.4、认同科学研究需要丰富的想像力,大胆质疑和勤奋实践的精神，以及对科学的热爱.基础知识1、萨顿的假说(１)内容：基因是由染色体携带着从亲代传递给下一代的,即基因就在染色体上.（2）原因：基因和染色体行为存在着明显的平行关系(3）研究方法：类比推理法。由两个或两类对象在某些属性上相同的现象，推断出它们在另外的属性上也相同的一种推理方法。(4）推理:①独立性：基因在杂交过程中保持完整性和独立性，染色体在配子形成和受精过程中，也有相对稳定的形态结构②存在方式：体细胞中染色体和基因成对存在,在配子中只有成对中的一个。③来源:体细胞中成对的基因一个来自父方,一个来自母方，同源染色体也是如此。④非等位基因在形成配子时自由组合,非同源染色体在减数第一次分裂后期也是自由组合.思考：萨顿认为基因和染色体存在什么关系？提示:平行关系.2.基因位于染色体上的实验证据(１)实验者:摩尔根。（2)实验材料：果蝇。（相对性状多且明显、培养周期短、成本低易饲养、染色体数目少便于观察、繁殖率高)(3)实验过程及现象：P红眼（雌）×白眼（雄）↓F1红眼(雌、雄）↓Ｆ2红眼（雌、雄）白眼(雄)３/41/4(4）提出问题:白眼性状与性别相联系.(5)作出假设:控制白眼的基因在X染色体上,Y染色体上不含有它的等位基因。（6）理论解释:（7）设计测交实验:Ｆ1红眼雄果蝇与白眼雌果蝇测交。（8）结论:白眼基因在Ｘ染色体上.摩尔根通过实验,将一个特定的基因(控制白眼的基因w)和一条特定的染色体（X染色体)联系起来，从而用实验证明了：基因在染色体上。思考:果蝇的红眼基因在哪里?若雄果蝇是红眼，与白眼雌果蝇杂交子代果蝇中红眼的是什么性别?提示:红眼基因在X染色体上。红眼的都是雌性。３。基因和染色体的关系基因在染色体上呈线性排列,一条染色体上有许多个基因。4．孟德尔遗传规律的现代解释(１）基因的分离定律的实质：①在杂合子的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性;②在减数分裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子中,独立地随配子遗传给后代。(2)基因的自由组合定律的实质:①位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的;②在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。思考：基因型为AａBb的个体能够产生四种配子的根本原因是什么？提示：减数分裂第一次分裂时，等位基因分离的同时，非等位基因自由组合。重点难点1.萨顿假说的证明摩尔根利用果蝇的杂交实验证明了萨顿假说是正确的，证明方法是假说-演绎法，与孟德尔的假说—演绎法相同。（1)发现问题：果蝇的白眼性状总是与性别相关.（2）提出假说:控制白眼的基因在X染色体上,Y染色体上不含它的等位基因.(3)证明假说:利用测交实验，让白眼雌果蝇与F1中的红眼雄果蝇交配,证明了控制白眼性状的基因位于X染色体上。(4）得出结论:基因在染色体上。特别提醒：摩尔根成功的原因：把特定的基因与特定的Ｘ染色体联系在一起,从而证实了基因在染色体上。2．分离定律的实质规律总结（1）分离定律的实质是等位基因在减数分裂产生配子时随着同源染色体分开而分离。(２）基因分离定律的验证方法是测交法（子代表现型比是1∶1)或自交法(子代表现型比是3∶1)。3.自由组合定律的实质４.核遗传两大遗传基本规律的比较规律事实

分离定律自由组合定律研究性状一对两对以上控制性状的等位基因一对两对以上等位基因与染色体的关系位于一对同源染色体上分别位于两对或两对以上同源染色体上细胞学基础（染色体的活动)减Ⅰ后期同源染色体分离减Ⅰ后期非同源染色体自由组合遗传实质等位基因分离非同源染色体上的非等位基因自由组合F１基因对数12或ｎ配子类型及其比例21∶１2２或２n数量相等配子组合数442或4nF２基因型种类332或3ｎ表现型种类２２2或2ｎ表现型比3∶1（3∶1）2或（3∶1）ｎＦ1测交子代基因型种类22２或2n表现型种类222或2n表现型比1∶1（１∶１)n规律总结①两定律均发生于减数第一次分裂后期，同时发生，同时发挥作用。②非同源染色体上的非等位基因的自由组合是在同源染色体分离的基础上进行的,基因的分离定律是自由组合定律的基础。③两定律均发生在真核生物有性生殖过程，是核基因的遗传规律.基因工程原理内容提要基因工程又称基因操作、重组DNＡ技术，是P.Ｂerg等于１9７2年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”.该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达.基因工程中使用多种工具酶,包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶,属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为三大类.Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小,专一性强,切割的方式有平切和交错切，作用时需要Mg＋＋作辅助因子,但不需要ATP和SAM。第一个被分离的Ⅱ类酶是HｉndⅡ。连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶,有DNA连接酶和RＮA连接酶之分。基因工程中使用的连接酶来自于原核生物,有两种类型的ＤNA连接酶∶E．coｌiDNＡ连接酶和Ｔ4－ＤNA连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E．cｏli中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒ＤNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。DＮA重组连接的方法大致分为四种：粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法.粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法，是指具有相同粘性末端的两个双链ＤNA分子在DNＡ连接酶的作用下,连接成为一个杂合双链DNA。平末端连接是指在T４DNA连接酶的作用下,将两个具有平末端的双链ＤNA分子连接成杂种DNA分子。同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工粘性末端，外源DＮA和载体DＮA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dＡ（dG）和dT(ｄC）,然后在ＤNA连接酶的作用下，连接成为重组的DＮA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段，但方法较繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列)，加到载体或外源ＤNA的分子上，然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。基因文库分为基因组文库、cDNA文库等,是指在一种载体群体中,随机地收集着某一生物DNA的各种克隆片段，理想地包含着该物种的全部遗传信息。DNA重组分子在体外构建完成后,必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组ＤＮA分子的转化。目前常用的诱导感受态转化的方法是ＣａCl２法(图３－20），此外也可以用基因枪等方法转化外源ＤＮA。重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等.基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景,并形成了一大批生物技术产业.基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA分子)，按预先设计的蓝图,在体外构建杂种ＤＮA分子,然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品;或是研究基因的结构和功能，揭示生命活动规律。基因工程技术诞生于２0世纪７０年代初，它是一门崭新的生物技术科学，它的创立和发展使生命科学产生了一次重大飞跃,证明并实现了基因的可操作性，使人类从简单地利用天然生物资源走向定向改造和创造具有新品质的生物资源的时代.基因工程技术诞生至今已经取得了辉煌的成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注目的前沿学科之一,基因工程也是当今新的产业革命的一个重要组成部分。第一节基因工程技术的诞生基因工程又称基因操作（geｎemａniｐｕlatｉｏn），重组DＮA（rｅcomｂinａntDNＡ）技术，是70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。一、基因工程技术的诞生1972年，P.。Berg等在PＮAS上发表了题为∶“将新的遗传信息插入SV40病毒DNA的生物化学方法:含有λ噬菌体基因和E.cｏli半乳糖操纵子的环状SV４0DＮＡ”，标志着基因工程技术的诞生。ＳV40病毒是猿猴病毒,是一种直径为４50的球形病毒,分子量为２8×１06道尔顿。ＳV40的DNA是环状双链结构，全长５24３个碱基对，编码三个衣壳蛋白VＰ1、VP2、VP3和一个T抗原。SＶ40DNA上有一个限制性内切酶Ｅ.cｏRⅠ的切点.Berｇ等首先用化学方法构建了一个二聚体的环状SV40DNA（图３—１）。图３—1重组的SV４0二聚体的构建（引自Berget.aｌ，1972）当时所用的连接方法是同聚物谱尾法，重组体的鉴定主要是通过电子显微镜比较分子量大小.当获得二聚体SV40DNA后,Ｂerｇ等就证明了环状DNＡ被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。于是他们进行第二步的实验就是从λｄvgalDＮＡ中制备含有E．coli的半乳糖操纵子DNＡ，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功.Bｅｒg等的工作是人类第一次在体外给遗传物质动手术，标志着一个新时代的到来,为此他获得了１98０年诺贝尔化学奖.二、基因操作的基本过程和特点基因工程的操作可用图3-2表示∶图３-２基因工程的基本过程（引自Oｌd＆Primrｏse,1９80）它所涉及的过程可用“分（合成)、切、连、转、选、鉴”六个字表示。分(合成)∶指DNA的制备，包括从生物体中分离或人工合成。分离制备或合成制备DNA的方法都有很多种。切∶即在体外将DＮA进行切割,使之片段化或线性化。连∶即在体外将不同来源的ＤNA分子重新连接起来,构建重组ＤNA分子.转∶即将重组连接的DＮA分子通过一定的方法重新送入或细胞中进行扩增和表达.选∶从转化的全群体中将所需要的目的克隆挑选出来；鉴∶就是进行对筛选出来的重组体进行鉴定,因为有些重组体并非是所需要的,必需通过分析鉴定.基因工程有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。遗传重组是生物进化的推动力，自然界中发生的遗传重组主要是靠有性生殖。基因工程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作,构建在生物体内难以进行的重组,然后将重组的遗传物质引入相应的宿主细胞,让其在宿主细胞中进行工作。这实际上是进行无性繁殖,即克隆，所以基因工程通常有称为基因克隆。第二节限制性内切核酸酶外科医生给患者动手术需要手术刀，基因工程师们给ＤＮA分子(基因)动手术需要分子手术刀，这就是工具酶。基因工程中使用的工具酶很多,包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DＮA合成与修饰的酶类，最重要的是限制性内切核酸酶。基因工程上把那些具有识别双链DＮA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割ＤNＡ双链结构的核酸内切酶统称为限制性内切核酸酶。一、限制性内切核酸酶的发现1９5２年Luria、Human在T偶数噬菌体、１９５3年ｗｅigle、Bertanｉ在λ噬菌体对大肠杆菌的感染实验中发现了细菌的限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深入研究,导致限制性内切核酸酶的发现。噬菌体在某一特定细菌宿主中生长的能力,取决于它最终在其中繁殖的细菌是什么菌株。例如,将A噬菌体从一株大肠杆菌转移到另外一株，其生长效率往往会削弱，对这两个菌株的滴定度可差好几个数量级。第二个菌株释放的噬菌体能百分之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染原来的宿主菌,再将释放的子代噬菌体重新感染第二个菌株时,感染率要大大下降。此种现象即为宿主控制的限制作用（host-Contrｏllｅdｒestrictioｎ）。用放射性同位素标记的噬菌体进行的实验结果表明，在受感染的宿主细胞中,噬菌体生长的限制伴有噬菌体DNA的迅速降解，然而，用作繁殖噬菌体的感染宿主菌株并不导致类似的噬菌体DNＡ的降解.如果某一细菌细胞具有一种能选择性降解来自侵染病毒（或其他来源)的核酸酶，那么，它必须能将这种外来DNA同它自己的DNA区分开来,之所以能够如此，乃是通过稍为宿主控制的修饰作用（ｈoｓｔ—cｏnｔrolｌedmoｄificatiｏｎ）。因此，限制（resｔrictiｏn)作用是指细菌的限制性核酸酶对DNＡ的分解作用，限制一般是指对外源DNA侵入的限制.修饰(modiｆiｃatｉon）作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构改变的作用（如甲基化),经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。到20世纪60年代中期，科学家推测细菌中有限制－修饰系统(restｒictioｎ—ｍｏdifｉｃatioｎsystｅm。Ｒ—Msyｓｔem)。该系统中有作用于同一DＮA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DＮA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位。一般说来，不同种的细菌或不同种的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制—修饰系统。1968年，Meseｌｓon从E．colｉＫ株中分离出了第一个限制酶EcoK，同年Ｌｉnn和Aeber从E。cｏliB株中分离到限制酶ＥcｏB.遗憾的是，由于EcoK和ＥcoB这两种酶的识别和切割位点不够专一,在基因工程中意义不大。１970年,Sｍitｈ和Wiｌcｏｘ从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶，能够特异性地切割DNＡ，这个酶后来命名为HｉnｄⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶.由于这类酶的识别序列和切割位点特异性很强，对于分离特定的DＮＡ片段就具有特别的意义.二、限制性内切核酸酶的命名和分类（一)限制性内切核酸酶的命名按照国际命名法,限制性内切核酸酶属于水解酶类。由于限制性酶的数量众多,而且越来越多,并且在同一种菌中发现几种酶。为了避免混淆，1973年Ｓmｉtｈ和Nａthaｎs对内切酶的命名提出建议,1９８0年，Ｒobｅｒｔs对限制性酶的命名进行分类和系统化。限制性酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的个一个首字母，再加上序号,将限制性内切核酸酶的命名要点列于表3-１。表3—1限制性内切核酸酶的命名要点条目要点基本原则３—4个字母组成,方式是：属名+种名+株名+序号首字母取属名的第一个字母，且大写第二字母取种名的第一个字母，小写第三字母①取种名的第二个字母,小写;②若种名有词头,且已命名过内切酶，则取词头后的第一字母代替第四字母若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定顺序号若在同一菌株中分离了几个限制性内切核酸酶，则按先后顺序冠以Ｉ、ＩＩ、IＩI,....。等如：EcｏＫ：Ｅsｃherichiacoli

Ｋ（大肠杆菌K株）（二)限制性内切核酸酶的分类限制性内切核酸酶的作用特点，将它们分为三大类。１.I类限制性内切核酸酶I类限制性内切核酸酶的分子量较大，一般在３0万道尔顿以上，通常由三个不同的亚基所组成。例如限制性酶EcoB是由R（135kD),M(6２ｋD）和S（55ｋD)三种亚基组成的复合酶,这三个亚基分别由不同的基因编码。全酶的总分子量为4４9ｋＤ,共5个亚基，其中Ｒ亚基和M亚基各两分子。Ⅰ类酶不仅是一种核酸内切酶,同时在酶分子上还具有甲基化酶和ATPａse的活性，所以是具有多种酶活性的复合酶类.作用时除了需要Mg++作辅助因子外，还要求ATP和Ｓ腺苷甲硫氨酸（ＳAＭ）的存在。Ⅰ类酶具有特异的识别序列，大约１5个碱基对。Ⅰ类酶虽然能够在一定序列上识别ＤＮA分子，并能同DＮA分子作用，因其识别DＮA后,要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为10０0个碱基左右），并且要形成一个环才能切割DNA(图３—3)，所以识别位点和切割位点不一致,产生的片段较大.图3－３I类酶的作用方式（引自Lｅwin，1９97)２．Ⅲ类限制性内切核酸酶Ⅲ类限制性内切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亚基组成类似于Ⅰ类酶,作用方式基本同Ⅱ类酶。如EcoＰ1是由两个亚基组成，一个亚基（Ｍ亚基）负责位点识别和修饰。另一个亚基(Ｒ亚基)具有核酸酶的活性(图３—5)。切割DＮA时需要ATＰ,Mg2+,也能被ＳAM激活,但并非必需。图3-４Ⅲ类限制性内切核酸酶（引自Ｌewin,1997)3。Ⅱ类限制性内切核酸酶这类酶的分子量较小.一般在2—４万道尔顿，通常由2—４个相同的亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA,极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNＡ,或DNA/RNA杂种双链。这类酶的专一性强,它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此,Ⅱ类酶既具有切割位点的专一性，也具有识别位点的专一性，一般在识别序列内切割.切割的方式有平切和交错切，产生平末端的ＤＮＡ片段或具有突出粘性末端的DNＡ片段（５'或３’粘性末端).作用时需要Mg+＋作辅助因子，但不需要AＴＰ和SAM.Ⅱ类酶与对应的甲基化酶在蛋白亚基上尚未发现有什么关系，第一个被分离的Ⅱ类酶是HiｎdⅡ。三。Ⅱ类限制性内切核酸酶的性质1。识别序列的特异性在３类限制性内切核酸酶中，Ⅱ类限制性内切核酸酶的特异性最强。大多数Ⅱ类限制性内切核酸酶识别的序列是回文序列。如ＢamHＩ和BglI都是识别六个碱基的ＤNA序列(图3—5）,都是完全的回文序列。这段序列有两个基本的特征,第一是能够中在间划一个对称轴,两侧的序列两两对称互补配对，第二个特点是两条互补链的5'到3'的序列组成相同，即将一条链旋转180０，则两条链重叠。图３—5Ⅱ类限制性内切核酸酶识别的回文序列(引自D．Ｖoet＆VoｔｅJ．G.1995)2．限制性内切核酸酶的切割频率与速度切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA分子中预测的切点数。由于ＤNA是由四种类型的单核苷酸组成，假定DＮA的碱基组成是均以的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的,那么对于任何一种限制性内切核酸酶的切割频率,理论上应为１/４ｎ，n表示该限制性内切核酸酶识别的碱基数。如识别4个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每256个碱基有一个识别序列和切点（１/44=1/2５６)，识别5个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每1０24个碱基有一个识别序列和切点，余下类推。实际上因DＮA的分布是不均一的,且有大量的重复序列,加上内切酶的切点具有GC倾向，所以实际的频率偏低.如同是识别6个碱基的限制性内切核酸酶，切割的频率相差很大∶EcoRI4０00；BaｍＨI：6０00；SalI:8０00;HpａＩI:200.根据限制性内切酶切割DNA所产生的产物末端,发现限制性内切酶对DNA的切割有两种方式,即平切和交错切。所谓平切，就是限制性内切酶在DNA双链的相同位置切割DNＡ分子,这样产生的末端就是平末端.交错切就是限制性内切酶在DNA双链的不同位置切割DNＡ，产生的ＤNA片段的末端不是平齐的(图３—６）。图3-６平末端与黏性末端（Ｈarｔl,1991）Ⅱ类限制性内切酶的切割产物有平末端和粘性末端(ｃohesiveend)。粘性末端是指DＮＡ分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分,这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对，形成双链.并在DNA连接酶的作用下,使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子.不同限制性内切酶切割DNＡ产生的三种不同类型的末端（表3－３）.表3-3某些限制性内切酶及产生的末端５'-粘性末端3’粘性末端平末端酶识别序列酶识别序列酶识别序列TaqＩT/CＧAＰｓtICTGCA／GＡluIＡG/CTＣlａIAT/CGATSacIGＡGCT/CFnuDⅡCG/CＧMboI／ＧATＣSpｈIGＣATG/CＤpnIＧＡ／TＣBglⅡA/GＡTCＴBｄeIＧＧCGC/CＨaeⅢGG/CCBaｍHＩG/GAＴCＣApaＩＧGGCC/CPvuⅡCAG/CＴGBclIT/GATCAKpnIGＧTＡC/CＳmaＩCCC/GＧＣＨindⅢＡ／AGCＴT

NaｅIＧCＣ/GGCNcｏIＣ/ＣATGG

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ＭｓtIＴＧC/GＣASａlIG／TCGＡC

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ＥcoRⅤＧAT/ＡＴC基因的分子手术是相当复杂的过程，除了需要限制性内切酶外,还需要其他一些工具酶包括连接酶、ＤＮＡ聚合酶、ＲNA聚合酶、核酸酶、末端修饰酶等，对DＮA或RＮA进行各种各样的修饰。其中最重要的是连接酶。第三节基因工程载体载体（vectｏr,ｖehiｃｌe)的本意就是媒介体,基因工程上的载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DＮA分子,称为克隆载体。基因工程中有三种主要类型的载体∶质粒DNA、病毒DＮＡ、科斯质粒，其中质粒DNＡ是最常用的载体,但运载能力低，柯斯质粒是质粒和λ噬菌体ＤNA的结合体，运载能力最高（图３—7）.在这三种类型的基础上，根据不同的目的,出现了各种类型的改造载体.图３-７三种类型的载体（引自Ｇｒeenｅ，１9９８）一、质粒载体质粒（plasｍiｄ）是染色体以外的遗传物质，它是双链闭合环状ＤＮA分子，其大小可从１kb到200kb左右，能够在宿主内利用宿主的酶系统进行复制。质粒是基因工程的主要载体。（一）质粒概念１９46—194７年间，Lederｂerｇ和Ｔatuｍ发现了细菌的接合现象,这是细菌的有性繁殖方式。此后不久，便弄清了这种接合是两种不同的交配型(接合型）,遗传信息总是从供体（雄性）转移到受体(雌性）。当两种不同的交配型的细菌相互识别和接合以后，雄性细胞的致育因子，通过细胞的表面结构传递到雌性细胞,这种致育因子后来称为Ｆ因子。1952年，Lｅderberｇ指出，细菌的F因子与高等生物细胞质中染色体外的遗传单元极为相似，并正式提出了“质粒”这一名称，以区别于染色体的遗传单元.一般来讲，质粒是细胞中能够独立复制的复制子，并在细胞分裂时能稳定传递给子代细胞。虽然质粒对细胞的生存没有影响，但质粒ＤNA上也有一些编码基因，赋予宿主细胞一些特性.自发现能赋予细菌性别特征的F因子以后,又在大肠杆菌中发现了一种能够编码抗菌物质-—大肠杆菌素的Col质粒，包括CｏｌB，ＣolV,ColE等。由这些因子产生的抗菌物质称细菌素（bacｌeｒiocｉn）,是细菌所合成的一种蛋白质,对于同种或近缘种具有毒性。合成细菌素的能力和对于细菌素的抗性，都由染色体外的遗传因子所控制。在1９５9一1960年间,日本科学家在研究用强效抗生素治疗菌痢患者时,发现病原菌志贺氏菌含有使其同时能抗几种抗生素的基因，而且,这种抗药性基因能以和Ｆ因子非常相似的方式转移给其他肠道细菌,这就是抗药因子（Ｒ因子）.抗药因子（ｒesｉｓtanｃefactoｒ)实际上是控制细菌抗药性的一种质粒，能在细菌间转移，由抗药性转移因子和抗药性基因两部分组成。每个抗药因子上常具有几个抗药性基因。（二）质粒DNA的基本性质大多数质粒ＤNＡ是是环状双链的DNA分子。如果两条链都是完整的环，这种质粒ＤNA分子称为共价闭合环状DNA(ｃｏvalentlｙclosｅｄcircuｌar,CＣCDNA）。CCCDNA有两种构型,超螺旋DNＡ(sｕpｅrcoｌｉedＤNA，SCDNＡ)和松弛的DNA(RelａxedDNA），分别是由ＤNA促旋酶(DNAｇyｒasｅ)和拓朴异构酶（topoisoｍerase）作用的结果。如果质粒DNA中有一条链是不完整的，那么这种DNA分子就称为开环的（opeｎｃircleｓ，OCＤNA），开环的ＤＮＡ通常是由内切酶或机械剪切造成的图3—8).从细胞中分离质粒DＮA时，质粒DNＡ常常会转变成超螺旋的构型。图３—8质粒ＤNA的三种构型(引自Old＆Ｐrimrose,1９８0)溴化乙啶（etｈｉdiumｂromide,EtBｒ）是一种扁平的分子，能够插入到DNＡ分子的碱基对之间，引起双螺旋的部分解旋，从而改变了DNA的体积和密度。图3—９相对分子质量相同构型不同的质粒DNＡ的琼脂糖凝胶电泳（引自Old&Primrosｅ，1980)由于不同构型的ＤNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同,CCＣDNA的泳动速度最快，ＯＣDNA泳动速度最慢，LDNA居中(图3-9）,所以很容易通过凝胶电泳和EB染色的方法将不同构型的DNＡ分别开来。（三）质粒分类根据质粒的拷贝数将质粒分为松弛型质粒和严紧型质粒。质粒拷贝数(ｐｌasmidcopｙｎumbｅｒs)是指细胞中单一质粒的份数同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同,ﻫ松弛型质粒（ｒｅlaxｅｄplasmid）的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约,因而有较多的拷贝数.通常可达10—15个/每染色体。并且可以在氯霉素作用下进行扩增，有的质粒扩增后,可达到3００0/每染色体(ColE１，可由24个达到1000至3０00个）。这类质粒多半是分子量较小，不具传递能力的质粒。基因工程中使用的多是松弛型质粒。严紧型质粒(strinｇeｎｔplａｓｍiｄ)在寄主细胞内的复制除了受本身的复制机构的控制外,还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少,一般只有1-２个/每染色体。这种质粒一般不能用氯霉素进行扩增。严紧型质粒多数是具有自我传递能力的大质粒.质粒的复制特性是受复制子控制的.基因工程中使用的质粒多数是松弛性质粒载体。(四)载体的条件就克隆一个基因（DＮA片段)来说,最简单的质粒载体也必需包括三个部分（图３-10)∶复制区，含有复制起点;选择标记,主要是抗性基因;克隆位点，便于外源ＤNA的插入.就复制特性来讲，要求载体必需有独立的复制起点,最好是松弛型复制，这样便于得到大量的拷贝.有时需要有多个复制起点，能够在不同的宿主细胞中复制,扩大宿主范围。具有合适的克隆位点,便于外源DNA的插入。克隆位点实际上限制性酶切位点,最好是具有多种限制性内切酶的单切点，这样适应性强，克隆方便,如果一种酶在载体上有多个切点，就会限制该切点的使用.具有可检测的选择标记,也是一个重要的基本条件，这种选择标记最好是能够赋予宿主易于检测的表型.选择标记就是常说的报告基因(reporｔgenes），包括抗生素抗性标记,以及一些生化表型的标记.另外，一个理想的质粒载体必需具有低分子量，因为小分子的质粒DNＡ易于操作,不容易被损伤，也容易被分离纯化。一般说小分子量的质粒分子的拷贝数比较高，酶切位点也少。图3-1０质粒载体的基本结构二、杂合载体除了质粒载体外,噬菌体的ＤNA也可作为载体,不过都是改造过的，自然病毒的ＤNA不能作为载体。目前在基因工程中使用的载体大多是质粒和噬菌体的杂合载体。（一)柯斯质粒(coｓmid)载体ｃｏsmid是英文cosｓite-ｃａrrｙiｎgplasｍｉd的缩写，本意是带有粘性末端位点的质粒,因此，柯斯质粒是人工建造的的含有λDＮA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体.柯斯质粒的构建一般都是利用质粒的复制子、选择标记，加上λ的coｓ位点序列及与包装有关的序列，构建的科斯质粒可以很好地用于基因克隆（图3—1１）。图3—11柯斯质粒载体克隆（引自Lｏdｉshetal，1９86）早期构建的科斯质粒载体有一些不足，如克隆位点较少,抗性标记单一，容栽能力不大,后来进行了一些改进,克服了这些不足.柯斯质粒具有如下特点:具有质粒复制子。目前构建的柯斯质粒大多具有pMＢ1复制子或ColＥ1复制子，所以进入寄主细胞后能够象质粒一样进行复制,并且能够被氯霉素扩增。具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记.如果在这些标记中有克隆位点的话可用插入失活法进行筛选。例如上面构建的MuA—３就具有四环素抗性基因。具有λ噬菌体的包装和转导特性。由于柯斯质粒具有λDNA的cos位点和相应的包装序列，因此在克隆了适当大小的外源ＤＮA以后可以被包装进入噬菌体蛋白颗粒,并能进行转染。转导的能力比纯的质粒大3个数量级。进入寄主细胞后，又可以自我环化。但它不能同寄主的染色体DNA整合，也不会产生子代噬菌体裂解寄主.溶载能力大。这是柯斯质粒的最大优点.被克隆的DNＡ大小具有上限和下限，这是因为柯斯质粒最后是被包装到噬菌体颗粒，它的最后大小应在噬菌体基因组的75％-105％之间.由于载体分子一般在5kb左右，所以克隆的最大片段在45kb；如果载体的分子量为15kb的话,克隆的最小片段为１9kb。因此柯斯质粒适合构建真核生物的基因库，而不适合克隆原核生物的基因。（二）ｐＵC载体系列的构建美国加州大学的Vｉｅｉra和Mｅsｓinｇ利用pＢＲ322和M１３载体的优点，构建了一个更小的载体,称为pUC7(图3-12），并在此基础上发展了pUC载体系列。图3-12pＵC载体的构建(引自Wiｎnａcker，1987)pUC载体具有很多优点∶①多克隆位点;②松弛复制；③有氨苄青酶素抗性;④可通过化学显色筛选。现在最常用的pUC载体是ｐＵＣ1８(图3-13），它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制,在正常情况下，它的拷贝数可达上千个,所以不需要用氯霉素进行扩增.图3—13ｐUC18质粒载体图谱二、基因文库技术基因文库（GeneLｉｂrary)是指在一种载体群体中，随机地收集着某一生物DNA的各种克隆片段，理想地包含着该物种的全部遗传信息（图3—18）.因此，基因文库是人工构建的某一生物基因的“活期储蓄所”，根据构建方法的不同,分为基因组文库、ｃDNA文库等.根据基因库的含量,又分为全库和特异性的库，全库含有某一生物的全部遗传信息，而特异性的库是不完整的,如差示库.早期将通过构建基因文库来筛选所需克隆的方法称为鸟枪法.图３-18基因文库技术（J。J．Greenｅ&RａoV.B．，19９8)第三节体外重组一、体外重组的方法DNＡ重组连接的方法大致分为四种:粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。1.粘性末端连接法粘性末端连接（Cohesiｖeenｄｌiｇａtion）是指具有相同粘性末端的两个双链DＮA分子在DNＡ连接酶的作用下，连接成为一个杂合双链DNA（图3－14）.粘性末端可由识别回文序列的内切酶所产生，或是用末端转移酶来制备。凡是识别回文序列的内切酶切割ＤNＡ产生的末端都是粘性末端，只有用同一种酶切割产生的相同粘性末端才能通过末端单链的碱基配对并在DNA连接酶的作用下进行连接.图3—14黏性末端连接法(引自Ｓnyｄer＆Ｃhａmｐneｓs，1９７7）粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法，酶切片段基本不需作什么处理就可以用于连接,既经济又省时.由于大多数限制性内切酶都可以产生粘性末端，操作方便。另外,通过粘性末端连接的重组体，其外源片段很容易回收，只要用原来的酶切割重组体就可以了.另外，也可以通过双酶切来获得黏性末端，并可进行定向重组连接（图3—1５).图3-15双酶切进行定向重组连接（引自Ｓnyｄeｒ＆Chamｐnｅss,１97７)平末端连接(ｂlｕnteｎｄliｇａtion)是指在T４DNA连接酶的作用下(可加入适量的ＲＮA连接酶）,将两个具有平末端的双链DＮA分子连接成杂种DNA分子。平末端连接的效率比粘性末端连接的效率低得多，所以通常在连接反应体系中要适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂,以提高平末端DNＡ连接的效率.常用的是PEＧ8000，加入后,可以起到两个作用：一是可将平末端连接的效率提高1－3个数量级;二是改变连接产物的分布,抑制分子内的连接，促进分子间的连接,得到的连接产物主要是重组体。平末端连接的不利之处是连接效率低,需要大量的连接酶，有时为了提高连接效率，通常要补加ＲＮA连接酶。连接后,缘由的限制性内切酶内切酶的切点要消失,所以不易回收插入的外源ＤNA片段。3.同聚物加尾法所谓同聚物加尾（ｈomopolymertａilsjoｉninｇ)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的３＇端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端,外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dＡ(ｄG）和dT（dＣ）,然后在ＤNA连接酶的作用下，连接成为重组的DＮA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段，但方法较繁,需要λ核酸外切酶、Ｓ1核酶、末端转移酶等协同作用（图3-16)。同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法,具有很多优点：①首先不易自身环化，这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的,所以不存在自身环化。②因为载体和外源片段的末端是互补的粘性末端，所以连接效率较高。③用任何一种方法制备的ＤNＡ都可以用这种方法进行连接，所以是一种通用的体外重组的方法。图3－16同聚物尾连接法（引自Oｌd&Pｒimｒosｅ，1９８0）１．基因组DNＡ文库所谓基因组文库(genomｉcDＮAＬibrａry）,就是用基因工程的方法,人工构建的含有某一生物基因组ＤNＡ的各种片段的克隆群。一般以改造的噬菌体ＤNA或柯斯质粒作为载体，包括下列过程（图3－19）：①高分子量染色体DNＡ的制备，②体外重组连接,③包装蛋白的制备，④重组体的体外包装,⑤将重组DNＡ导入寄主细胞，⑥筛选。建造基因组文库不仅可以大量扩增含量极少的单拷贝的结构基因，也可以克隆调控基因,有利于研究基因的结构、功能和调控机理。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库（ｇｅnepooｌ)是指在行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中,由于使用的载体不同,分为噬菌体载体和柯斯质粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAＣ文库。图3－1９基因组文库技术（引自Grifｆithsetal．１996）2.cＤＮA文库同mＲNA互补的ＤNA称为cDNA。mRNＡ为模板合成的cDNA可以用于基因的克隆化,也可用这种方法制备特异性的杂交探针。cＤNA文库是以某一生物的总mRNA为模板,在无细胞系统中，在反向转录酶的作用下，首先合成一互补的ＤNA,即第一链,破坏RＭＡ模板后,再以第一链为模板合成第二链,得到的双链DＮA称为ｃDNA基因.选用适合的载体,将合成的ｃDNA基因重组导入寄主细胞，经筛选得到的ｃＤNA基因的克隆群称为ｃDNA文库(cｏｍpletｅmｅntDNALiｂｒaｒy)(图3－20).由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因,因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。图3-２0cDNA文库构建(引自Olｄ＆Priｍrose,1９80)由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的,具有发育的阶段性和时间性，有些则需要特殊的环境条件。所以，cDNＡ文库是不可能构建得十分全,也就是说任何一个cＤNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因。所以在构建cＤNA文库时应根据研究目的的不同而选用不同的生物材料作为RNA分离的出发材料，有些甚至要经过特殊的诱导处理以提高所需DNA的丰度.第五节重组DNA的转移、筛选与鉴定转化是基因工程操作中一项十分重要的工作。DNA重组分子在体外构建完成后,必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DＮＡ分子的转化（tranｓformaｔioｎ)。重组体的筛选有两层涵义,一是将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来,二是将将携带有特定外源插入片段的重组体挑选出来。鉴定则是对筛选的重组体进行最后的鉴别.一、重组DＮＡ的转化能够接受转化作用的细菌的生理状态叫感受态.细菌的感受态是在适当的生长条件下获得的一种生理特征。要强调的是：感受态是有关转化因子被吸收的生理状态，而不是有关转化因子进入细胞后能否被接受的生理状态.处于感受态的受体细菌，其吸收转化因子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，而且不同细菌间的感受态差异往往受自身的遗传特性、菌龄、生理培养条件等诸多因素的影响。在自然条件下，大多数类型的细菌不出现感受态，也不发生转化。然而可以通过某些化学诱导的方法来制备感受态,用这种方法得到的感受态就称为人工诱导的感受态细胞。目前常用的诱导感受态转化的方法是CａCl2法(图3-２1)，此外也可以用基因枪等方法转化外源DＮＡ.图3－２1钙诱导的转化二、重组体的遗传学筛选法所谓遗传学方法(genｅticseｌｅcｔion)主要是根据受体细胞接受了重组DNA分子后所发生的遗传表型的变化直接选择重组体的方法。遗传表型的变化包括抗药性、缺陷基因的功能互补表型及噬菌斑的变化等.这些表型的变化,有些是载体提供的表型特征，有些则是插入序列提供的表型特征。选择的方法主要是根据平板上可见的表型变化,用于选择的平板包括普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表达抗生素平板、显色平板等,由于这些方法都是直接从平板上筛选，所以又称为平板筛选法。(一）插入失活筛选法从原理上讲，当外源基因（或DNA片段）插入到某一基因内的位点后，使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活(insｅrtiｏnaｌｉnactivａtiｏn)。图3－２2插入失活的原理图3－23聚合酶链反应（引自Watsonetal,1９9２)1.抗性基因插入失活筛选法根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的ｐBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的，表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是,如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段，就会造成四环素抗性基因失活,变成AprTcs,携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长，而不能在四环素抗性平板上生长(图３－２２)。2。蓝白斑筛选法根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影印复制,才能够将所需的重组体挑选出来，大大增加了筛选的工作量.后来，人们设计了以β—半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体,简化了筛选程序，提高了灵敏度。这类载体系统包括M13噬菌体、ｐUC质粒系统、pEGＭ质粒系统.它们的共同特点是载体上携带一段细菌的ｌaｃＺ基因，它编码β-半乳糖苷酶的一段1４６个氨基酸的α—肽,载体转化的受体菌为lａｃZΔM15基因型。这样,载体同宿主通过互补,具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基因中插入外源DＮＡ，造成laｃZ基因失活,不能合成α-肽,失去同宿主的互补，不能形成有功能的β－半乳糖苷酶,失去分解Ｘ—ｇaｌ的能力。在X—gal平板上，含阳性重组体的细菌为物色菌落（质粒载体）或无色噬菌斑(M１3噬菌体载体）;非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。显色反应筛选方法比较简单,但是β－半乳糖苷酶的合成需要诱导。实验中起诱导作用的是安慰诱导物－-IPTG（异丙基硫代—β－D-半乳糖苷),作用底物是Ｘ－gaｌ（5-溴—4－氯－3－吲哚-β-D-半乳糖苷)。通常是将Ｘ－gａl和IPTG混合后,涂布在固体平板的表面。(二）PCＲ法聚合酶链反应（poｌymerasｅchainｒeactｉon,PCR）是一种体外扩增特定DＮA序列的新技术，这种ＤNA的体外扩增是通过同DNＡ双链互补的两个引物在DNA聚合酶的作用下，进行引物延伸来完成的。在反应系统中，需要有：①模板（含有特定序列的DNA分子)。②两个寡聚核苷酸引物，这两个引物可同双链DNA分子的互补链杂交，并且位于靶DＮA欲扩增区的两侧。③耐热DNA聚合酶。④4种脱氧核糖单核苷酸.然后经过不同温度的循环进行ＤNA扩增（图3—23）.这一技术是KaryMulｌis在1985年发明的，并于1993年获得诺贝尔化学奖。ＰCR应用十分广泛，并且可通过菌液PｃR进行重组克隆的快速筛选。基本方法是从抗性平板上挑取单菌落接种至25０μL的ＬB培养基中,20０ｒ／miｎ振荡培养8h以后，取1μL菌液进行裂解制备模板进行PCR筛选。（三）核酸杂交筛选法核酸杂交又叫分子杂交（moleculａｒｈybridｉｚａtion)，是鉴定和筛选重组体的一种方法。原理是：两条具有碱基互补序列的ＤNＡ分子变性后，在溶液中一起进行复性时,可以形成杂种双链ＤNA分子。同样,一条DNＡ链与之具有互补碱基序列的RＮA链在一起复性时，也能形成双链结构（DＮA－RNA杂交体）。杂交包括下列过程:①DNA的“熔解”,即变性,目的是使双螺旋解开成为单链,这可将DNA溶液的温度升高超过Tm值(解链温度）即可；②退火，即DNA的复性，将加热过的ＤNA溶液缓慢冷却即可发生。杂交的双方是待测的核苷酸序列及探针.待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未经克隆的基因组DNA或是细胞总ＲNA。核酸杂交方法的两个特点是高度特异性及高度灵敏性.1．菌落杂交在大量筛选重组的细菌细胞时,需要从中寻找出为数极少的含有目的序列的细胞。另外。在利用插入失活、显色反应等手段得到含重组质粒的细菌细胞后，还需要证明这些重组质粒是否含所需要的目的序列。若将所得菌落逐个扩大培养，提取质粒ＤＮA，然后用Ｓｏuthern杂交法固然可以鉴定重组质粒，不仅工作量大，又耗费财力,用菌落杂交（colonyhybridizatioｎ)（图3—24)，就方便得多。首先要将转化的受体菌在合适的琼脂平板上制成单菌落，然后将菌落复制到硝酸纤维素滤膜上,保留主平板，将硝酸纤维素滤膜上的菌落进行原位溶菌、原位释放ＤＮA、原位进行ＤNA变性、中和洗涤后进行原位固定。然后同特异的探针进行杂交，通过放射自显影后,有杂交信号的即为重组体，对照主平板则可将重组体选择出来.图３—24菌落杂交的基本过程（引自Olｄ＆Primrose，１9８0)2.Sｏuｔｈern杂交Sｏuｔｈerｎ杂交（Soｕtherｎｈybrｉｄizaｔion）是1975年Southｅrn建立起来的一种杂交方法，属固相-液相杂交。该法的主要特点是利用可毛细现象将ＤNＡ转移到固体支持物上,称为Soｕtheｒn转移或Souｔhern印迹（Ｓｏｕtｈernｂlottinｇ）。它首先用合适的限制性内切酶将DNA切割后，进行电泳分离后，利用干燥的吸水纸产生毛细作用，使液体经过凝胶,从而使DNA片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物表面,然后进行杂交（图３—25）。图3-２５Sｏｕｔheｒn杂交中的DＮA转移（引自Aｌｂertsetal.2002)3．Nｏｒtｈern杂交Northｅrn杂交（NｏrｔheｒnＨｙbｒidizａtion）是分析ＲNA的一种方法,它的基本原理是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离,再转移到尼龙膜等固相膜载体上,用放射性同位素标记的DNA或RNA特异探针对固定于膜上的mRNA进行杂交,洗膜去除非特异性杂交信号,经放射自显影，对杂交信号进行分析.将杂交的mRNＡ分子在电泳中的迁移位置与标准分子量分子进行比较，即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小，对杂交信号的强弱比较,可以知道该基因表达mＲNA的强弱。这一技术应用十分广泛,常用于基因表达调控、基因结构与功能、遗传变异及病理研究。主要用来检测外源基因在受体细胞中是否转录成RNA。

Ｎｏrｔｈern印迹的原理同Ｓoｕthern印迹.但有两点不同:其一是转移的对象不同，Norｔherｎ印迹是将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过程。其二,虽然RNＡ电泳前不需向DNA那样进行酶切,但也需要变性。不过变性方法是不同的，它不能用碱变性，因为碱变性会导致RＮA的水解.ﻫNoｒthern杂交与Soｕｔｈeｒn杂交的主要区别是在变性剂存在下，用琼脂糖进行电泳分离ＲNA。变性剂的作用是防止RNA的二级结构发夹环的形成,保持其单链线性状态.第六节生物技术及应用基因工程技术的发展推动了生物技术(bｉoteｃ}lnokogy）的发展，现代生物技术作为一门综合性的学科，与现代微生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、分子生物学和化学工程等多学科密切相关。生物技术产业从２0世纪８0年代开始起步，经过20年的发展，目前在农牧业、食品、医药等领域得到广泛的应用.生物技术产业市场逐渐形成，其前景广阔,将成为21世纪经济的支柱产业。(一)细胞工程细胞工程(ｃｅllenginｅｅrｉng）是利用细胞的全能性，在细胞或细胞器水平上改变细胞的某些遗传特性,以改良其性状、获得有用基因产物或加速细胞及生物体繁殖的综合技术,可分为微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程，是以细胞培养技术为基础,通过细胞融合、细胞核移植、动物克隆、染色体工程和生物反应器来实现。1．细胞融合细胞融合(cｅllfｕｓiｏn)又称体细胞杂交(sｏmaｔicｈｙbｒidizatioｎ），是指两个不同来源的细胞，彼此融合成杂交细胞,使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，打破远缘生物不能杂交的屏障，形成新物种或新品种的技术。1９75年，英国剑桥大学的科学家科莱尔(G．Kohｌｅr）和米尔斯坦(C。Milｓtｅｉn)用细胞融合技术将能分泌抗体的B淋巴细胞(绵羊红细胞、免疫小鼠脾细胞）与具有无限生长能力的肿瘤细胞（小鼠骨髓瘤细胞）融合，得到了既能持续产生单一抗体又能在体外无限繁殖的杂合细胞（杂交瘤细胞，hyｂridomaｃell)(图３—2６)，通过细胞培养将杂合细胞克隆为单纯的细胞系（单克隆系),由此类细胞系可获得结构和特性完全相同的高纯度抗体，即单克隆抗体（moｎoｃlonalanｔibody，ＭcＡb)。这一技术的创立在生物医学领域取得重大突破，两位科学家因而荣获１9８４年诺贝尔生理医学奖。图3—26利用细胞融合技术制备单克隆抗体(引自Kuby，1９9４)如今这种细胞融合技术已在动物间实现了小鼠和田鼠,小鼠和小鸡，甚至于小鼠和人等许多远缘和超远缘的体细胞杂交。虽然目前动物的杂交细胞还只停留在分裂传代的水平，不能分化发育成完整的个体，但在理论研究和基因定位上都有重大意义。而植物间的细胞融合所得到的杂交细胞,获得了新的杂交植物，如西红柿与马铃薯细胞融合获得“西红柿马铃薯”，羽衣甘蓝与白菜型油菜细胞融合得到“甘蓝型油菜"等.２．细胞核移植细胞核移植是将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的显微操作技术.由于主要遗传物质存在于细胞核内，因而此技术可获得遗传上具同质性状的动物,对动物优良杂交种的无性繁殖和濒临绝迹的珍贵动物的传种具有重大意义。1952年,美国科学家布里格斯（R．Ｂrigｇs）首次利用豹纹蛙卵细胞建立了细胞核移植技术.1981年，瑞士科学家Ｋ．111menses率先对哺乳动物小鼠卵细胞进行核移植获得成功。他将灰鼠的细胞核注入到除去了精核和卵核的黑鼠的受精卵内,然后再将这一f'Ｆh黑鼠细胞质和灰鼠细胞核组成的卵细胞体外培养,得到的仔鼠是灰色的，说明仔鼠的性状取决于细胞核的来源。在细胞核移植技术上发展起来的动物体细胞克隆技术在1997年因克隆羊“多莉”（Doｌlｙ)的诞生而取得了重大突破.英国科学家维尔穆特（I．ｗilmｕt)等1９9７年２月27日在《自然》描述了“多莉”的克隆过程(图3—27）.他们取出六龄的芬兰多塞特白绵羊母羊的乳腺细胞核,将此核导入苏格兰黑绵羊去核的卵细胞内，待手术完成之后，以相同频率的电脉冲刺激换核卵，让苏格兰黑绵羊的卵细胞质与芬兰多塞特白绵羊母羊乳腺细胞的核相互协调,使这个“组装”细胞在体外发育成早期胚胎，然后将胚胎植入另一只母羊的子宫内，产下了小绵羊“多莉”。“多莉”不是由母羊的卵细胞和公羊的精细胞受精的产物,而是体细胞核加去核的卵细胞质,不经两性结合诱导出来的胚胎产生的。“克隆羊"的诞生表明：动物体中执行特殊功能、具有特定形态的所谓高度分化的细胞与受精卵一样具有发育成完整个体的潜在能力。图３—27克隆羊“多莉”诞生的过程（引自Gｌiｃｋ&Pasternak,1998）19９8年,日本科学家利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生;同年,美国科学家用成年鼠的体细胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠；1９99年,夏威夷大学的科学家利用成年鼠体细胞克隆出第一只雄性老鼠;2000年１月，美国科学家宣布克隆猴成功，这只恒河猴被命名为“泰特拉"；同年3月，曾参与克隆小羊“多莉”的英国PPL公司宣布,他们成功培育出５头克隆猪。200２年,我国科学家成功克隆出牛和山羊，使我国成为少数掌握体细胞克隆哺乳动物关键技术的国家之一.2０03年，美国、意大利等国科学家分别培育出世界上第一匹克隆骡子和克隆马。中国和法国科学家合作首次克隆出大鼠。（二）蛋白质工程蛋白质工程是根据分子设计的方案,通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质,而是经过改造的,具有了人类所需要特性的特殊蛋白质.天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的,而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，能更快、更有效地为人类服务。重组人ｐ干扰素（IFNp）的人工改造是蛋白质工程的一个成功范例。干扰素（ｉntｅrｆｅroｎ)是人体细胞分泌的一种蛋白质，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能，是人体防御系统的重要组成部分.重组人IＦNβ是采用重组DNA技术，克隆人β干扰素基因，构建合成干扰素的基因工程菌,经发酵、提纯、纯化制备而成。其基因工程产物活性为10万U／mg,仅是天然IFＮ口产物活性的１０%.蛋白质结构分析发现，人IFNβ由154个氨基酸组成，在１7、41、141位有3个半胱氨酸(Ｃys）,人体天然产物在4１、14１间形成二硫键，基因工程产物二硫键位置有偏差，17位Cyｓ的巯基参与二硫键,形成无活性的二聚体或寡聚体.由于丝氨酸（Ser）与半胱氨酸在结构上除羟基（-OH)与巯基(-ＳH）外完全一样，因此将１７位Cys点突变为Sｅr，结果证明人工改造的IFN口产物活性提高１00倍,稳定性好于天然产物。(三）酶工程酶工程（eｎzymeengineerinｇ)就是通过对酶的修饰改造,提高酶的催化效率并在某一生物反应器中大规模生产的技术过程，主要包括酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶分子修饰、酶和细胞固定化、酶反应动力学与反应器、酶的应用等。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中(表3—4).例如,固定化青霉素酰化酶用于连续裂解青霉素生产;α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶连续作用于淀粉,就可以生产出各类糖浆;利用葡萄糖苷酶可生产出低糖啤酒;蛋白酶用于除去毛皮中的特定蛋白，软化皮革等。加酶洗衣粉、用蛋白酶生产的嫩肉粉等,都是酶工程的产物。此外，酶工程还用于农副产品的加工利用。美国利用大豆生产出2０0余种产品,包括营养食品、药品、食品添加剂等，例如高纯度大豆卵磷脂、大豆蛋白等。目前工业生产的酶有６０余种,其中规模化生产仅２０余种.表３—4酶工程的主要应用领域应用领域酶类主要用途食品工业淀粉酶类葡萄糖、麦芽糖生产,啤酒酿造，面包、饼干等,烘烤食品制作等蛋白酶类嫩肉粉、饼干、蛋白胨、乳酪生产,啤酒澄清，肉类加工（如香肠熟化等）糖化酶淀粉液化，糊精降解葡萄糖异构酶高果糖浆生产葡萄糖苷酶低糖啤酒生产凝乳酶乳酪生产果胶酶果酒、果汁去浊纺织工业淀粉酶类纺织品褪浆纤维素酶处理纤维制品，提高棉毛纺织品质量蛋白酶类丝制品脱胶处理日化工业蛋白酶类加酶洗涤剂、加酶护肤品与化妆品生产淀粉酶类加酶洗涤剂生产超氧化物歧化酶化妆品生产糖酐酶牙膏添加剂制革工业蛋白酶类皮革去毛、软化医药工业青霉素酰化酶青霉素、头孢霉素生产羟化酶氢化可的松生产酪氨酸酶多巴(主治帕金森病）生产蛋白酶类氨基酸、蛋白水解液生产，治疗消化不良，消肿,降压等葡萄糖脑苷酯酶治疗高雪病(葡萄糖脑苷酯酶缺乏症)天冬酰胺酶治疗白血病溶菌酶消炎,镇痛，止血等尿激酶治疗心肌梗死、结膜出血等超氧化物歧化酶治疗红斑狼疮、皮肌炎、辐射损伤等链激酶治疗血栓性静脉炎、血肿等其他多种酶多种疾病诊断(如葡萄糖氧化酶诊断糖尿病，胆碱酯酶诊断肝炎等）环保工业淀粉酶类处理造纸工业废水溶菌酶处理高有机物含量废水丁酸梭菌酶系处理酿酒工业废水其他多种酶环境监测试剂（如胆碱酯酶监测有机磷农药,硫氰酸酶监测氰

化物等)(四）发酵工程发酵工程(fｅrmｅntａtioｎenｇineeｒinｇ）是利用微生物的特性，通过现代化工程技术，在反应器中生产目的产物或提供所需服务的技术过程.“发酵”一词来源于拉丁语动词ferｖerｅ（发泡），意指利用酵母以果汁或麦芽汁为原料生产酒精饮料时出现的现象。传统的发酵技术有悠久的历史，早在几千年前人类就利用有益的微生物生产食品和药物，如酒、醋、酱、奶酪等。现代发酵工程是在传统发酵工艺基础上结合基因工程、细胞工程、酶工程等现代高新技术发展而成，由于其主要以微生物培养为主，因而也称微生物工程.发酵工程由3部分组成(图3-2８）：上游工程、发酵过程和下游工程。其中上游工程包括优良菌株的选育、最适发酵条件(pH、温度、溶氧和营养组成)的确定、营养物的准备等.发酵过程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。这里要有严格的无菌生长环境,包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术，在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术,在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术,还有种子培养和生产培养的不同的工艺技术。图3-28发酵工程的基本流程微生物发酵产品可分为以下几大类:微生物细胞(生物量）作为产品,如单细胞（酵母）蛋白作为食品或饲料。微生物代谢物产品，目前医用抗生素、农用抗生素等已有近20０个品种,绝大部分都是发酵产品.此外，发酵产品还包括酒精、氨基酸、柠檬酸和工业用酶等。味精、多种维生素等也是发酵工程的产品。基因工程产品.微生物(如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌和酵母等)是最常用的重组基因的表达系统。主要产品包括干扰素、胰岛素、牛凝乳酶、G—ＣSF(粒细胞集落刺激因子）、ＥPO（红细胞生成素）和tＰA（重组组织型纤溶酶原激活剂）等。（五）生物医学工程生物医学工程（ｂiomediｃalenｇiｎeerinｇ)是综合生物学、医学和工程学的理论和方法而发居起来的新兴综合学科.生物医学工程开始以仿生学原理制造人工器官,如心脏起搏器、人造心脏、假肢等,以及用于诊疗手段的医学仪器。后来人体器官移植成为医疗中可以选择的手段，但常常要克服异体器官的排斥反应，在用药物能够解决排斥反应之前，人体器官移植成功的例子很少.由于生物技术迅猛发展,在ＤNA双螺旋结构发现5０年后,人类基因组计划已经完成，对人类基因全面了解后，人们已经将眼光投到干细胞克隆和治疗性克隆(非生殖性克隆),一些国家如美国建立了胚胎的干细胞系，用于包括治疗性克隆等方面的研究.国外已经成功地从自体鼻窿腔内取出干细胞，导人心脏,去除心脏因炎症等留下的疤痕,恢复了心脏的正常功能，以及用血液中的干细胞修复因车祸等造成四肢瘫痪患者的脊髓神经，使他们重新站立