园艺植物生物技术第七章2

第七章植物基因工程的基础知识与技术

李英(南京农业大学园艺学院)Tel科楼B6018E-mail:yingli@当前第1页\共有164页\编于星期三\22点课程主要内容第一章绪论第二章园艺植物组织培养的理论基础与基本技术第三章园艺植物脱毒与离体快速繁殖第四章园艺植物种质离体保存与无性变异系筛选第五章园艺植物的细胞工程第六章园艺植物的染色体工程第七章植物基因工程的基础知识与技术第八章园艺植物基因的分离与克隆第九章园艺植物遗传转化载体的构建第十章园艺植物遗传转化第十一章转基因技术在园艺植物育种的应用第十二章园艺植物的分子标记第十三章园艺植物生物信息学第十四章园艺植物生物技术的安全性评价与管理授课教师:李英,王建军,侯喜林当前第2页\共有164页\编于星期三\22点

基因工程是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的系列操作技术总称。外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。当前第3页\共有164页\编于星期三\22点第七章植物基因工程的基础知识与技术第一节植物遗传物质的基础知识第二节植物基因工程常用的工具酶第三节植物基因工程常用的载体第四节植物基因工程的基本技术当前第4页\共有164页\编于星期三\22点第一节植物遗传物质的基础知识核酸：是以核苷酸为基本单位组成的生物大分子。DNA,RNA核苷酸:碱基，戊糖，磷酸A,T,G,C;A,U,G,CΒ-D-2脱氧核糖遗传物质？当前第5页\共有164页\编于星期三\22点当前第6页\共有164页\编于星期三\22点第一节植物遗传物质的基础知识DNA的结构与功能RNA的结构与功能蛋白质的结构与功能遗传信息的传递基因的概念当前第7页\共有164页\编于星期三\22点一、DNA的结构与功能？DNA的一级结构指DNA分子中脱氧核苷酸按照一定的排列顺序，通过磷酸二脂键连接形成的多核苷酸。又称碱基顺序。DNA的二级结构即双螺旋结构。DNA的三级结构DNA双螺旋进一步扭结、折叠形成的更加复杂的结构称为DNA三级结构，这种双螺旋结构可再次螺旋形成超螺旋结构。当前第8页\共有164页\编于星期三\22点当前第9页\共有164页\编于星期三\22点当前第10页\共有164页\编于星期三\22点生物的遗传信息储存于DNA的核苷酸序列中，生物界物种的多样性就在于DNA分子4种核苷酸千变万化。当前第11页\共有164页\编于星期三\22点DNAModel当前第12页\共有164页\编于星期三\22点DNA右手双螺旋结构是DNA分子在水性环境和生理条件下最稳定的结构，但并不是不变的，当改变溶液的离子强度或相对湿度时，DNA结构会发生改变。当前第13页\共有164页\编于星期三\22点DNA超螺旋结构DNA超螺旋结构的存在可能有两方面的生物学意义，一方面，DNA双链经过盘绕压缩使松弛性DNA更为紧密，体积更小，更能保持稳定。另一方面，影响DNA双螺旋的解链过程，从而影响与其他大分子如蛋白质、酶的结合。当前第14页\共有164页\编于星期三\22点二、RNA的结构与功能mRNAmRNA存在于细胞质中，直接指导蛋白质的合成。tRNAtRNA是细胞内分子质量最小的一类核酸，由70~120核苷酸构成。rRNA是最多的一类RNA，也是3类RNA中相对分子质量最大的一类RNA，它与蛋白质结合而形成核糖体，其功能是作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，实现蛋白质的合成。rRNA单独存在时不执行其功能，它与多种蛋白质结合成核糖体，作为蛋白质生物合成的“装配机”。当前第15页\共有164页\编于星期三\22点当前第16页\共有164页\编于星期三\22点当前第17页\共有164页\编于星期三\22点当前第18页\共有164页\编于星期三\22点当前第19页\共有164页\编于星期三\22点当前第20页\共有164页\编于星期三\22点当前第21页\共有164页\编于星期三\22点三、蛋白质的结构与功能蛋白质的一级结构由氨基酸通过肽键连接成一条多肽链，由一个氨基酸的羟基和另一个氨基酸的氨基进行缩合反应产生。蛋白质的二级结构指多肽采取的不同构象。两种主要形式是α螺旋和β折叠，二者都由多肽的不同氨基酸之间形成的氢键所稳定。蛋白质的三级结构指将多肽链的二级结构组分折叠成为三维构型而形成的。主要被氢键、二硫键和疏水作用所稳定。蛋白质的四级结构即两条或更多已形成三级结构的多肽键组合在一起形成一个多亚基蛋白。不是所有蛋白都有四级结构。当前第22页\共有164页\编于星期三\22点定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。1.蛋白质的一级结构主要化学键：肽键

二硫键的位置属于一级结构研究范畴。当前第23页\共有164页\编于星期三\22点一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。胰岛素的一级结构3021当前第24页\共有164页\编于星期三\22点2.蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象

。定义：稳定因素：

氢键

当前第25页\共有164页\编于星期三\22点（一）肽单元(peptideunit)

参与组成肽键的6个原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽键平面。它是蛋白质构象的基本结构单位。当前第26页\共有164页\编于星期三\22点肽单元HHHH当前第27页\共有164页\编于星期三\22点当前第28页\共有164页\编于星期三\22点

蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(-helix)

-折叠(-pleatedsheet)

-转角(-turn)

无规卷曲(randomcoil)

当前第29页\共有164页\编于星期三\22点（二）-螺旋结构要点:

①多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧。②每圈螺旋含3.6个氨基酸，螺距为0.54nm。③每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴基本平行。当前第30页\共有164页\编于星期三\22点当前第31页\共有164页\编于星期三\22点当前第32页\共有164页\编于星期三\22点（三）-折叠①多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。②两段以上的β-折叠结构平行排列，两链间可顺向平行，也可反向平行。③两链间的肽键之间形成氢键，以稳固β-折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。

当前第33页\共有164页\编于星期三\22点当前第34页\共有164页\编于星期三\22点当前第35页\共有164页\编于星期三\22点（四）-转角和无规卷曲-转角：无规卷曲：没有确定规律性的肽链结构。①肽链内形成180º回折。②含4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与第四个形成氢键。③第二个氨基酸残基常为Pro。当前第36页\共有164页\编于星期三\22点-转角：当前第37页\共有164页\编于星期三\22点（五）模体蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间构象，被称为模体(motif)。当前第38页\共有164页\编于星期三\22点螺旋－环－螺旋

锌指当前第39页\共有164页\编于星期三\22点3.蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和VanderWaals力等。稳定因素：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。定义当前第40页\共有164页\编于星期三\22点

肌红蛋白(Mb)N端C端当前第41页\共有164页\编于星期三\22点纤连蛋白分子的结构域结构域(domain)大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行其功能，称为结构域。当前第42页\共有164页\编于星期三\22点结构域Triosephosphateisomerase当前第43页\共有164页\编于星期三\22点亚基之间的结合力主要是氢键和离子键。4.蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。每条具有完整三级结构的多肽链，称为亚基(subunit)。当前第44页\共有164页\编于星期三\22点血红蛋白（Hb）的四级结构当前第45页\共有164页\编于星期三\22点当前第46页\共有164页\编于星期三\22点（1.）一级结构是空间构象的基础蛋白质结构与功能的关系牛核糖核酸酶的一级结构二硫键当前第47页\共有164页\编于星期三\22点

天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性当前第48页\共有164页\编于星期三\22点（2）一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Glu·Glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Val

·Glu·····C(146)当前第49页\共有164页\编于星期三\22点

这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。当前第50页\共有164页\编于星期三\22点肌红蛋白与血红蛋白的结构（3.）蛋白质空间结构与功能的关系当前第51页\共有164页\编于星期三\22点（4.）蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。当前第52页\共有164页\编于星期三\22点蛋白质构象病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。当前第53页\共有164页\编于星期三\22点疯牛病疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病当前第54页\共有164页\编于星期三\22点1.DNA双螺旋结构发现（Watson

＆Crick,1953）四、遗传信息的传递TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962当前第55页\共有164页\编于星期三\22点CentralDogma2.中心法则提出（Crick，1958）Crick,1916-2004当前第56页\共有164页\编于星期三\22点反转录机制阐明（Temin1970

）补充的中心法则当前第57页\共有164页\编于星期三\22点五、基因的概念三大成就40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。当前第58页\共有164页\编于星期三\22点现在人们认为，基因是实体，它的物质基础是DNA或RNA，基因是具有一定遗传效应的DNA分子中特定的核苷酸序列，它是遗传信息传递和性状分化、发育的依据，基因是可分的。根据基因的产物可将其分为结构基因、调节基因、无翻译产物基因。简而言之，基因是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，它是遗传物质的最小功能单位。当前第59页\共有164页\编于星期三\22点第二节植物基因工程常用的工具酶限制性内切核酸酶DNA连接酶DNA聚合酶其他工具酶当前第60页\共有164页\编于星期三\22点常用工具酶及其功能限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶3′切除末端磷酸基DNA外切酶Ⅲ3′末端切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶5′末端切除单核苷酸当前第61页\共有164页\编于星期三\22点一、限制性内切核酸酶限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。

Ⅰ型限制性内切酶Ⅱ型限制性内切酶Ⅲ型限制性内切酶当前第62页\共有164页\编于星期三\22点定义：凡在识别并切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸顺序的酶统称为限制酶。名称属名（大写）种名（小写）株名分离序号来源菌体EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacollR株HindⅢHindⅢHaemophilusInfluenzaed株HindⅡHindⅡHaemophllusInfluenzaed株HpaⅠHpa/ⅠHaemophllusParainfluenzae限制性内切酶的命名举例当前第63页\共有164页\编于星期三\22点Ⅱ型限制酶的作用性质1、基本特性：（1）识别位点为4~8个核苷酸序列；（2）识别位点即为切割位点；（3）位点上核苷酸顺序通常呈双重旋转对称结构，即呈回文结构。5‘…GCT

GAATTC

GAG…3’3‘…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点当前第64页\共有164页\编于星期三\22点切割方式通常有三种：①在识别顺序两条链对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成齐平末端。如HaeⅢ，PvuII。②在识别顺序两条链对称轴上两侧同时从5’端切断磷酸二酯键，形成5’磷酰基端2-5个核苷酸单链粘性末端。如EcoRⅠ。③在识别顺序两条链对称轴上两侧同时从3’端切断磷酸二酯键，形成3’羟基端2~5个核苷酸单链粘性末端。如PstⅠ。当前第65页\共有164页\编于星期三\22点PvuII等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

当前第66页\共有164页\编于星期三\22点EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

Ho-G-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP当前第67页\共有164页\编于星期三\22点PstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP当前第68页\共有164页\编于星期三\22点当前第69页\共有164页\编于星期三\22点二、DNA连接酶（一）DNA连接酶和T4DNA连接酶DNA连接酶1976年发现，广泛存在于细胞内。目前应用的多数来自于大肠杆菌，称为E.coliDNA连接酶。分子量74000dal,辅因子NAD+,其作用是封闭双螺旋骨架上具有5‘-磷酰基和3’-羟基的缺口，形成磷酸二酯键。DNA连接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick（T4DNA连接酶）当前第70页\共有164页\编于星期三\22点T4DNA连接酶T4DNA连接酶来自于T4噬菌体感染的E.coli，为T4噬菌体自身的表达产物。分子量6.8万dal，辅因子位ATP，该酶既能连接粘性末端，亦能连接齐平末端。修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键T4-DNA连接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’当前第71页\共有164页\编于星期三\22点连接多个平头双链DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

T4-DNA连接酶当前第72页\共有164页\编于星期三\22点（二）连接酶的作用

用DNA连接酶，可催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组分子。具体做法是，在体外将具有粘性末端的DNA限制片断，插入到适当载体分子上，再用DNA连接酶连接，从而可以按照人们的意图构建出新的DNA杂种分子。当前第73页\共有164页\编于星期三\22点

DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a.DNA的粘性末端；b.DNA的平末端；c.化学合成的具有粘性末端的DNA片段。当前第74页\共有164页\编于星期三\22点三、DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段T4DNA聚合酶反转录酶T7噬菌体DNA聚合酶当前第75页\共有164页\编于星期三\22点（一）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要作用是采用缺口平移法标记DNA，制备放射性DNA探针，用于核酸杂交分析。DNA聚合酶Ｉ的酶活性：

1.5’-3’的聚合酶活性；

2.5’-3’的外切酶活性；

3.3’-5’的外切酶活性（较低）。当前第76页\共有164页\编于星期三\22点（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经舒替兰酶处理，去除全酶中的5’3’外切核酸酶活性，保留了5’3’聚合酶活性和3’5’外切核酸酶活性。当前第77页\共有164页\编于星期三\22点（三）T4DNA聚合酶T4DNAPolymerase，即T4DNA聚合酶，是一种模板依赖的DNA聚合酶，可以在结合有引物的单链DNA模板上，从5‘→3’方向催化DNA合成反应。T4

DNA

Polymerase具有3‘→5’外切酶活性，但不具有5‘→3’外切酶活性。

特点：可以用于将5‘端突出末端补平或3’端突出末端削平。T4

DNA

Polymerase的3‘→5’DNA外切酶活性对于单链DNA要比双链DNA活性更高，即单链DNA要比双链DNA中的非配对链部分更容易被T4

DNA

Polymerase所消化。T4

DNA

Polymerase的3‘→5’外切酶活性比KlenowFragment要高约200倍。

当前第78页\共有164页\编于星期三\22点（四）反转录酶反转录酶（reversetranscriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。当前第79页\共有164页\编于星期三\22点（五）T7噬菌体DNA聚合酶

T7噬菌体DNA聚合酶来源于T7噬菌体感染的E.coli，为两种紧密结合的蛋白质复合体，一种是噬菌体基因5蛋白，另一个是宿主蛋白的硫氧还蛋白。T7噬菌体DNA聚合酶是所有DNA聚合酶中持续合成能力最强的一个，产物平均长度要大得多，在测定核苷酸序列时有优势。它的活性功能与T4噬菌体DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶类似，但3‘--5’外切活性为Klenow的1000倍。T7噬菌体DNA聚合酶可替代T4的功能并可用于长模板的引物延伸。Sequenase（测序酶）是美国UnitedStatesBiochemical公司改造的T7噬菌体DNA聚合酶，切除了99%以上的3'--5'外切活性。SequenaseVersion2切除了所有的3'--5'外切活性，是用双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。当前第80页\共有164页\编于星期三\22点四、其他工具酶末端转移酶碱性磷酸酶DNA甲基化酶S1核酸酶当前第81页\共有164页\编于星期三\22点（一）末端转移酶

分子克隆中常用的末端转移酶来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA聚合酶，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3‘-OH。若dNTP为T或C，此二价阳离子首选CO2+；若dNTP为A或G此二价阳离子首选Mg2+。在基因工程中，利用末端转移酶不需要模板，dNTP中任何一个都可以作为反应前体物的特征，给平末端DNA片段3‘-OH加上同聚物poly(C)或poly(G)，也可以加上poly(T)或poly(A)，形成同聚物加尾构建重组技术。当前第82页\共有164页\编于星期三\22点（二）碱性磷酸酶碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。当前第83页\共有164页\编于星期三\22点碱性磷酸酶的活性当前第84页\共有164页\编于星期三\22点碱性磷酸酶的应用当前第85页\共有164页\编于星期三\22点（三）DNA甲基化酶原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。在E.coli中，大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶。甲基化酶使DNA分子的腺嘌呤或胞嘧啶碱基甲基化，免受内源性限制酶切割，从而将能被限制性内切酶识别的未被甲基化的DNA分子和不可识别的甲基化方式的DNA分子区别开来，起到保护DNA分子的作用。当前第86页\共有164页\编于星期三\22点（四）S1核酸酶来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。当前第87页\共有164页\编于星期三\22点核酸酶SⅠ的应用当前第88页\共有164页\编于星期三\22点第三节园艺植物基因工程常用的载体能将目的基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的遗传因子谓之为基因工程载体。当前第89页\共有164页\编于星期三\22点相关概念有用基因亦称为目的基因或插入物用于接受重组DNA的扩增载体及其插入物或表达目的基因的受体细胞谓之宿主插入物的扩增过程称为分子克隆携带重组DNA分子的宿主为基因工程细胞（菌）或重组细胞（菌）当前第90页\共有164页\编于星期三\22点基因工程载体的必备条件1、能自主复制2、具有可供选择的遗传标记3、具克隆位点4、能携带大小不同的外源性目的基因、载体分子量要小,

载力要大5、载体特征明确：基因，酶切位点，核苷酸序列当前第91页\共有164页\编于星期三\22点质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体人工染色体载体当前第92页\共有164页\编于星期三\22点一、质粒质粒是能自主复制的双链环状DNA分子质粒的生物学性质①分子量小，差异显著，1-500kb。②易于在宿主间转移和迁移。③在宿主内可伴随宿主染色体复制而复制，与宿主呈共生关系。④且其存在与否与宿主生死无关。⑤编码宿主染色体不具有的基因，赋予宿主细胞额外遗传特性（如抗生素抗性）当前第93页\共有164页\编于星期三\22点pBR322

是一种人工构建的重要质粒

特点：①带有多种抗药性的强选择标记②具有低分子量，高拷贝③外源DNA插入不影响复制功能④有多种核酸内切限制酶单切割位点命名:p：表示质粒

BR:分别取自两位主要构建者F.Bolioax

和R.L.Rodrignez姓氏的头一个字母

322:指实验室编号当前第94页\共有164页\编于星期三\22点普通型载体pBR322的结构图1、来源于pSF2124质粒易位子Tn3的ampr2、来源于pSC101质粒的tetr3、来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点当前第95页\共有164页\编于星期三\22点pBR322质粒载体的优点①自身分子量小4363bp②同时具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号③具有较高的拷贝数当前第96页\共有164页\编于星期三\22点pUC质粒载体pUC质粒是在pBR322载体质粒的基础上，组入了一个在其5‘端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。pUC取名是根据它们的加州大学(UniversityofCalifornia)的科学家J.Messing和J.Vieria于1987年首先构建的当前第97页\共有164页\编于星期三\22点(1)pUC质粒载体的结构pUC系列质粒载体包括以下四个组成部分：①来自pBR322质粒的复制起点ori）；②氨苄青霉素抗性基因Ampr，但它的DNA中核苷酸序列已发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点；③大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称为lacZ`基因；④位于lacZ’基因中的靠近5`端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。当前第98页\共有164页\编于星期三\22点pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal5-溴-4-氯靛蓝（蓝色）当前第99页\共有164页\编于星期三\22点(2)pUC质粒载体的优点①具有更小的分子量(2686bp)和更高的拷贝数(500～700)②适用于组织化学方法检测重组体③具有多克隆位点MCS区段，可以更方便的插入外源基因当前第100页\共有164页\编于星期三\22点二、噬菌体载体(一)λ噬菌体DNA1、λ噬菌体的结构和性质λ噬菌体为双链DNA病毒，宿主为E.Coli。在宿主内有溶菌和溶源两种形式，在溶源方式中，噬菌体感染宿主后其DNA整合到宿主染色体DNA中，伴随宿主染色体复制而复制。当前第101页\共有164页\编于星期三\22点当前第102页\共有164页\编于星期三\22点λ噬菌体DNA是有48502bp组成的线性双螺旋分子，分子量3.1×107dal。迄今已定位的基因至少61个，其中一半参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的“必要基因”；另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的“非必要基因”。这为其作为基因工程噬菌体的基础。当前第103页\共有164页\编于星期三\22点2、

λ噬菌体DNA克隆载体野生型的λDNA不适宜作为克隆载体。因为⑴其分子量较大，⑵常用的限制酶切点较多。如EcoRI切点5个，HindⅢ切点7个，而这些切点大多位于溶菌周期生长所必须基因内，容纳不下比其更大的外源性DNA片段，必须对其进行改造。当前第104页\共有164页\编于星期三\22点改造后，可构建两类λ噬菌体派生载体①取代型载体或替换型载体（replacementvector）它具有成对的克隆位点，这两个位点之间的λDNA

区段可以被外源插入的DNA片段所取代。如λEMBL4

和Charon40。当前第105页\共有164页\编于星期三\22点②插入型载体（insertionvectors）只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点（也有一些具有两个插入位点）。外源性DNA克隆到插入型的λ载体分子上会使噬菌体的某中生物功能丧失，即所谓插入失活效应。如免疫功能失活的和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的两种亚型。当前第106页\共有164页\编于星期三\22点特点：以λ噬菌体DNA为载体构成的重组DNA分子必须包装成完整病毒颗粒后才具有感染宿主的能力。经包装后重组DNA分子转化率提高100-1000倍。这类载体可以有效克隆15kb大小的外源基因。当前第107页\共有164页\编于星期三\22点1、概述λ噬菌体一般有效克隆外源基因范围仅为15kb左右，但有些基因可达35-40kb，甚至更大，同时λ噬菌体不能够同时克隆两个连锁基因。为此，1978年，J.Collins及B.Hohn等人发展出科斯质粒载体，可满足以上需要。“cosmid”一词是由英文“cossite-carryingplasmid”缩写而成，其愿意是指带有粘性末端位点(cos)的质粒。三、柯斯载体(cosmid)

当前第108页\共有164页\编于星期三\22点定义：科斯质粒是人工构建的，含有λDNA的粘性(cos)末端序列、质粒复制起始区及质粒一个抗药性标记的、兼具质粒与λ噬菌体DNA载体双重性质的特殊载体。当前第109页\共有164页\编于星期三\22点当前第110页\共有164页\编于星期三\22点当前第111页\共有164页\编于星期三\22点当前第112页\共有164页\编于星期三\22点2、Cosmid的特点目前已有许多不同类型的科斯质粒载体，其特点如下：①具有λ噬菌体的特性；②具有质粒载体特性；③具有高容量的克隆能力；④具有与同源序列的质粒进行重组的能力。当前第113页\共有164页\编于星期三\22点四、人工染色体载体

YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。真核生物染色体的几个关键部分：着丝粒端粒自主复制序列当前第114页\共有164页\编于星期三\22点当前第115页\共有164页\编于星期三\22点第四节植物基因工程的基本技术核酸分离技术核酸电泳技术核酸体外扩增技术分子杂交技术当前第116页\共有164页\编于星期三\22点一、核酸分离技术（一）

DNA的提取CTAB法SDS法当前第117页\共有164页\编于星期三\22点DNA提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中当前第118页\共有164页\编于星期三\22点1.RNA的不稳定性由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基，RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活（二）

RNA的提取当前第119页\共有164页\编于星期三\22点

2’-deoxyribosesugarsPhosphodiesterlinkagesDirectionalchain(5’to3’)4Basespurines:adenine&guaninepyrimidines:cytosine&thymineDNAisapolymerof

2’-deoxyribonucleotidesGCTAp5’end3’endCGTAHO-CH2OH2N-CCCHNNNCHCONOOOPOCH2OOCNNCHCCHNH2NH2CCNNNCHCNHCOOOPOCH2OO-PO32OOOPOCH2ONCCOHNCHCOCH31’2’3’4’5’3’当前第120页\共有164页\编于星期三\22点RNAisapolymerofribonucleotides

ribosesugarsPhosphodiesterlinkagesDirectionalchain(5’to3’)4Basespurines:adenine&guaninepyrimidines:cytosine&uracilGCUApCGUA5’end3’end1’2’3’4’5’3’OHHO-CH2OH2N-CCCHNNNCHCONOOOPOCH2OOCNNCHCCHNH2OHOOOPOCH2ONCHCOHNCHCOOHNH2CCNNNCHCNHCOOOPOCH2OO-PO32OH当前第121页\共有164页\编于星期三\22点RNAiseasilyhydrolyzedunderalkalineconditionsThereactionproceedsthrougha2’,3’-cyclicmonophosphateintermediate.EnzymatichydrolysisofRNAbyRNaseproceedsthroughasimilarintermediate.BecauseDNAlacksthe2’-OHgroup,itisstableunderalkalineconditions.....OPO-CH2OOONOHOOPOCH2OONOHOOPOO...OHONOHOOPOO...HOCH2O....OPO-CH2OONOOPOOH+....OPO-CH2OOONOHOOPOHOmixtureof2’-and3’-monophosphatederivativesH2OshortenedRNARNA当前第122页\共有164页\编于星期三\22点提取RNA的注意事项(1)玻璃制品、塑料制品和电泳槽:玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。(2)研究人员造成的污染:经常更换新手套(3)污染的溶液:避免交叉污染。当前第123页\共有164页\编于星期三\22点常用RNA酶抑制剂

焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。异硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。当前第124页\共有164页\编于星期三\22点RNA提取的步骤材料的裂解杂质的去除RNA的吸附或沉淀异硫氰酸胍，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物，使DNA及蛋白沉淀到有机相。硅质材料的吸附或用异丙醇沉淀浓缩RNA。经DEPC处理的水溶解RNA当前第125页\共有164页\编于星期三\22点材料准备及裂解尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位，现取现提。组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组织选取杂质少的部位,细菌和酵母需要匀浆处理。对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入专门的RNA样品储存液中保存。液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。当前第126页\共有164页\编于星期三\22点杂质的抽提采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和DNA分布到中间层和有机相中，RNA留在水相中对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机溶剂抽提当前第127页\共有164页\编于星期三\22点RNA的沉淀和溶解含RNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集沉淀，70％乙醇洗涤，晾干用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA样品收集后或需长期保存时应置于－70℃或加入RNase抑制剂，分装使用当前第128页\共有164页\编于星期三\22点二、核酸电泳技术自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。当前第129页\共有164页\编于星期三\22点基因组DNA的检测提取的基因组DNA片段在20kb－30kb之间高质量的基因组DNA

带型单一无拖尾现象DNA浓度及纯度的检测（A260=1约50μg/mL双链DNA；A260/280约为1.8）

当前第130页\共有164页\编于星期三\22点RNA的检测电泳槽系统的处理含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳RNA纯度及浓度的检测（A260=1，约40μg/mLRNA；

A260/A280

约为1.9-2.1）当前第131页\共有164页\编于星期三\22点琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。当前第132页\共有164页\编于星期三\22点

溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。当前第133页\共有164页\编于星期三\22点

普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳。当前第134页\共有164页\编于星期三\22点三、核酸体外扩增技术——PCR技术PCR基本概念PCR基本原理及示意图PCR反应的组成物质PCR反应体系及扩增程序由基本PCR拓展的相关技术当前第135页\共有164页\编于星期三\22点PCR技术

（Polymerasechainreaction）当前第136页\共有164页\编于星期三\22点

PCR(Polymerasechainreaction)即：聚合酶链式反应，是指在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，也称无细胞分子克隆系统。是1985年由美国的KaryB.Mullis等人首创并由美国Getus公司开发的一项专利，应用该方法可使极微量的特定DNA片断在几小时内迅速扩增到百万倍。具有特异性强，灵敏度高和快速准确的优点，因而发展迅速，应用范围越来越广泛，不仅可用于基因表达调控，基因克隆与测序，特异基因筛选等基础研究，而且在医学、农业科学等领域得到了广泛的应用。TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1993KaryB.Mullis（1944–）

LaJolla,CA,USA1.PCR基本概念当前第137页\共有164页\编于星期三\22点2.PCR技术的基本原理

根据已知的待扩增的DNA片段序列，人工合成与该DNA两条链末端互补的两段寡核苷酸引物，在体外将DNA模板在酶促作用下进行扩增。PCR全过程可分为DNA模板变性、退火、延伸三个步骤，经若干循环所组成。首先高温作用使模板DNA变性解链，然后降低温度使引物与模板DNA链退火，在TaqDNA聚合酶作用及dNTP底物存在下，引物链将沿着5’

～3’方向延伸与模板互补的新链，新链则可作为下一次反应的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。通常单一拷贝的基因经25~30循环可扩增100万～200万拷贝。当前第138页\共有164页\编于星期三\22点未扩增的DNAA上游引物B下游引物5'端是人工合成的引物，是特定的，3'端没有固定的终止点特定的扩增产物在第2个循环中出现，以后快速扩增，成为主要扩增产物BABBABAABABABABA循环1变性退火延伸循环2变性、退火延伸靶序列未扩增的DNA当前第139页\共有164页\编于星期三\22点循环3n个循环后，5'端是特定的人工合成的引物，3'端没有固定的终止点的DNA链扩增量为2n。变性、退火延伸ABBBAABAABBABABABABBA当前第140页\共有164页\编于星期三\22点3.PCR反应的组成物质

完成PCR反应的组成物质主要有引物、dNTPs、DNA聚合酶(Taq酶)、缓冲液、Mg2+及DNA模板等，其基本特征和要求介绍如下。当前第141页\共有164页\编于星期三\22点3.1引物引物是与待扩增DNA片断两侧互补的寡核苷酸，是决定PCR扩增特异性的关键因素，引物设计与合成的好坏直接决定PCR扩增的成效。引物设计主要考虑：⑴引物长度一般为15～30碱基，太短容易产生许多不同的DNA扩增片段，产生与非靶序列的杂交；太长影响PCR效率。⑵碱基组成引物3’不应超过3个连续的G（或C），引物自身及引物间不应存在互补序列，否则易形成引物二聚体。⑶引物3‘不能进行修饰，由于引物与模板结合后，是从3’开始延伸引物的，第一位的错配将影响扩增效率。当前第142页\共有164页\编于星期三\22点3.2dNTP

dNTPs是PCR反应所必须的底物，为四种核苷酸的混合物(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)。最适宜的dNTPs终浓度应根据被扩增片断的长度和碱基组成来确定。当前第143页\共有164页\编于星期三\22点3.3DNA聚合酶

目前PCR扩增中最常用的DNA聚合酶是TaqDNA，它是由水生栖热菌产生，热稳定性好。它的用量多少对PCR扩增效率及特异性有一定影响。另外近年来还使用耐热的PfuDNA聚合酶和rTthDNA聚合酶，nTthDNA聚合酶可由其将RNA反转录后扩增出大量的DNA片断，大大减化操作程序，提高了效率。当前第144页\共有164页\编于星期三\22点3.4缓冲液、Mg2+、DNA模板PCR常用的缓冲液是10～50mmol/L的Tris-HCl(pH8.3～8.8)体系，注意不能把不同厂家的Taq酶与缓冲液交叉使用。Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活剂，其浓度高低明显影响PCR产物的特异性和产量。一般选用2～5mmol/L的浓度。作为模板的可以是染色体DNA，也可是质粒DNA，通常PCR反应体系中所需的模板的量是102～105拷贝的靶序列。当前第145页\共有164页\编于星期三\22点4.PCR反应体系（20μl反应体系）1.6μldNTP(2.5mmol/L)，1.6μlMg2+(10mmol/L)，0.2μlTaqE(5U/μl)，1μlDNA(25ng/μL)，1μlupperPrimer(10μmol/L)，1μllowerPrimer(10μmol/L)，2.0μl10×Buffer，11.6μlH2O当前第146页\共有164页\编于星期三\22点PCR扩增程序

94℃变性3min；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃保温10min。反应停止后加溴酚蓝5μL进行电泳，扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳，1×TAE作电泳缓冲液。电泳结束后将凝胶置于紫外可见分析仪上观察照相。

当前第147页\共有164页\编于星期三\22点5.由基本PCR拓展的相关技术简并PCR逆转录PCR(reversetranscriptionPCR)、反向PCR(invertedPCR)、巢式PCR(nestedPCR)、锚定PCRRealtimePCR分子标记：RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)、AFLP(Amplifie