植物分子育种之细胞工程

植物分子育种之细胞工程第一页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日植物分子育种是指把供体带有目的性状的遗传信息分离提取出来，导入待改良植物细胞中，使它整合、表达和遗传，并根据人们的农业生产需要选育出带有目的性状的优良个体，培育出具有农业经济价值的新品种。第二页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日细胞工程：是指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术

基因工程：目的基因的定位、分离、重组、表达等。

分子标记辅助育种：DNA分子遗传标记，或DNA标记。第三页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日

第一节植物细胞工程概述第四页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日一、植物细胞工程概念(Definitionofplantcellengineering)：1、植物细胞工程是植物生物技术的一个重要组成部分，是在离体培养条件下，细胞水平上对植物材料进行遗传操作的技术，即对植物体的任何一个部分（器官、组织、细胞、原生质体）进行离体诱导使其称为完整植株的技术。第五页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日小麦胚组织培养示意图第六页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日

技术应用植物组织与细胞培养技术―作物品种改良

植物细胞大批量培养技术―名贵药物、生物药品植物细胞融合技术―――――创造新植物种植物染色体工程技术――――创造作物新类型DNA重组技术―――――――植物改良外源基因导入技术――――――植物改良与物理、化学技术相结合―――植物改良2、植物细胞工程所涉及到的主要技术和应用第七页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日二、研究任务

通过植物细胞工程这一技术手段，在离体培养条件下研究植物组织、器官、细胞、原生质体经离体诱导形成的愈伤组织形态发生规律、外界环境条件和培养基对它的作用以及由其诱导而形成的再生植株群体的遗传稳定性和变异性。第八页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日三、植物细胞工程的基本理论1、植物细胞工程的基本理论：（1）细胞是构成植物有机体的结构和生命活动的基本结构单位。（2）植物细胞的全能性，即植物细胞是在生理上和发育上具有潜在全能性（totipotent）的功能单位。第九页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日*1838年，M．J．Schleiden提出细胞学说，1839年T．Schwann认为细胞学说也适用于动物。即细胞是生物有机体结构与功能的及基本单位。*1902年，德国植物学家G．Haberlandt提出了“细胞全能性”理论。他本人被誉为“植物组织培养之父”。2、植物细胞工程发展过程第十页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日*1934年，White（怀特，美国）培养番茄根尖建立了无性繁殖系，获得了离体根培养的真正成功。1937年，他又发现了B族维生素对离体根生长的重要作用。1939年，怀特成功培养了烟草原形成层细胞。怀特研制出了White培养基。*1934年，Gautheret（高斯雷特，法国）培养山毛榉、黑杨的形成层组织，发现了生长素IAA的促进作用。1939年，他培养胡萝卜根形成层也获得成功。第十一页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日*1937～1938年，Nobecourt（诺必考特,法国）培养胡萝卜根和马铃薯块茎的薄壁组织成功。

在这个阶段，由于White、Gautheret和Nobecourt等人的出色工作，建立了植物组培的综合培养基。三人一起被誉为植物组织培养的奠基人。1943年，White重新提出了植物细胞全能性学说，并著了《植物组织培养手册》一书。第十二页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日*1958年，在美国Steward（施图尔德,英国）等从胡萝卜愈伤组织和细胞培养中诱导产生了胚状体，形成了完整的植株。首次证实了植物细胞全能性理论。进入60年代，植物组织培养技术进入飞速发展阶段，并应用于生产。*1960年，Morel（莫雷尔）培养兰花茎尖成功，实现了快速繁殖和去病毒的目的。该方法繁殖系数极高。第十三页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日

在我国，早在20世纪30年代，李继侗等进行银杏离体培养，获得了小植株。并发现培养基中加入银杏胚乳提取物可促进离体胚生长。罗宗洛等对玉米根尖培养成功。罗士韦将菟丝子茎尖培养成功并在试管内开花。第十四页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日植物细胞工程涉及部分概念

植物组织培养(Planttissueculture)外植体（Explant）：用于体外培养的植物组织。在组织培养中，我们把由活体植物（母体）上切取下来用作离体培养的那部分组织或器官。在组织培养中，我们把由活体植物（母体）上切取下来用作离体培养的那部分组织或器官。

愈伤组织(Callus)：从植物各种器官的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。器官发生（Organogenesis）：在组织培养和悬浮培养中由培养物形成根和芽的现象愈伤组织器官发生第十五页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日

胚状体（somaticembryos）：在离体培养过程中由外植体或愈伤组织产生与受精卵发育方式类似的胚胎结构现象脱分化（dedifferentiation）：已分化的细胞在一定因素作用下重新恢复分裂机能并改变其原来的发展方向而沿着一条新的途径发育的过程。再分化（redifferentiation）：脱分化的细胞团或组织经重新分化而产生新的具有特定结构和功能的组织或器官的一种现象。体细胞无性系变异（SomacloneandSomaclonalvariation）第十六页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日第二节植物细胞全能性以及分化和去分化第十七页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日一、细胞全能性概述一个细胞所具有的生产完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。细胞全能性的相对性不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应；即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体；动植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。第十八页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日

植物细胞按照分裂能力分为三类：第一类是始终保持分裂能力，如茎尖、根尖及形成层细胞；第二类是永久失去分裂能力的终端分化细胞。如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞；第三类是在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可以重新启动分裂的G0细胞，如表皮细胞及各种薄壁细胞。一个植物细胞向分生状态恢复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处位置和生理状态。第十九页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日根据细胞类型不同从强到弱：营养生长中心＞形成层＞薄壁细胞＞厚壁细胞（木质化细胞）＞特化细胞（筛管、导管细胞）根据细胞所处的组织不同从强到弱：顶端分生组织＞居间分生组织＞侧生分生组织＞薄壁组织（基本组织）＞厚角组织＞输导组织＞厚壁组织第二十页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日细胞全能性脱分化细胞分裂再分化个体再生细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性的前题，再分化是细胞全能性表达的最终体现。第二十一页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日二、细胞脱分化培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化离体培养下，脱分化过程发生在第一次有丝分裂之前。静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。第二十二页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（一）细胞脱分化过程可分为3个阶段：第二十三页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日(二)细胞生理与结构变化第二十四页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（三）、细胞脱分化的调控机理细胞周期对脱分化的调控PSK的发现及其对细胞脱分化的影响激素诱导表达基因与细胞脱分化细胞脱分化与染色体解凝聚第二十五页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日1细胞周期对植物细胞脱分化的调控第二十六页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日CycD基因首先表达生成CycD,在相关调节因子的帮助下CycD复合体使CDKa活化，进而对Rb(G1期限制点调控分子)磷酸化，使细胞通过“限制点”进入分裂周期后，则CDKb与CycB以及相关的调节蛋白质完成从S期到M期的调控。2、第二十七页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日用3、植物激素的调控作用第二十八页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日植物硫化激动素(PSK)

是近年来发现的一种植物体内小分子肽类生长调节因子,具有促进细胞增殖等多种生物活性.第二十九页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日第三十页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日第三十一页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（四）、细胞脱分化与愈伤组织形成细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化必然会导致细胞分裂。对于单个细胞而言，分化细胞启动分裂发生在细胞完全脱分化之后。第三十二页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日器官，组织培养时细胞分裂首先发生在伤口部位－愈伤组织的形成是脱分化的细胞重新进入活跃分裂的结果，但不是脱分化的过程。－有些外植体的细胞脱分化以后，直接形成胚性细胞进而形成成体细胞胚。－在组织器官培养时，愈伤组织内的细胞脱分化过程是不一致的。第三十三页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日三培养细胞再分化所谓细胞分化（differentiation）,是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式的过程。从分化的遗传控制角度讲，细胞分化是各个处于不同时空条件下的细胞，基因表达与修饰差异的反应，所以，分化也可以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的不同表现型。细胞分化中基因组变化：基因表达产物及其调控与修饰是细胞分化的本质所在，越来越多的研究显示，细胞分化主要受基因在转录水平和转录后水平的调控，其中一些特异性蛋白质基因的表达调控在细胞分化过程中起到了重要作用。第三十四页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日极性与细胞分化所谓极性（polarity），是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理分化上的梯度差异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。第三十五页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日TE的形成与细胞分化通常把离体培养中TE(trachearyelements,管状分子)细胞的出现作为组织分化的标志。而极性的建立似乎又是微管发生的一个信号，极性建立后生长素按极性方向流动，导致TE细胞分化。由于TE细胞在分化过程中具有细胞壁加厚，原生质体自溶等容易观察的细胞特征，从而又为植物细胞分化研究提供了模式体系。第三十六页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日激素对细胞分化的调控作用激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素。生长素和细胞分裂素、GA3、ABA、乙烯如：细胞分裂素和生长素对于细胞生长和分化具有同等重要的协调作用，他们的量与比值的不同配合，对于细胞分化起着重要调节作用。先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂而不利于细胞分化。反之，则有利于细胞分化。如果两者同时处理，则可促使分化频率的提高。第三十七页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日

研究显示，植物激素对细胞生长与分化的调控是一个复杂的级联调控过程，离体培养条件下，由于外植体细胞所处的生理状态不同以及内源激素水平的差异，试图寻找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很难的。第三十八页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日第三节培养基的基本成分和主要培养基

培养基是植物组织培养成功的关键和保证。培养基是培养成功的关键，并因物种、同一物种不同型、同一基因型不同外植体的要求不同而有差异。第三十九页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日Media

同一物种不同基因型同一基因型不同外植体genus第四十页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日*1902年Haberlandt试图离体培养绿色叶肉细胞以解决碳源问题，但未能实现。因此离体培养必需依赖外来源。

*常用碳源为蔗糖、果糖、葡萄糖，其中蔗糖是最常用的，浓度为2－5％。

*其它形式碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露醇、乳糖

***高压灭菌和过滤灭菌对碳源的影响一、有机营养物（Organiccompounds）1、糖第四十一页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日培养基的发展过程1865年Knop盐溶液培养基1939年Gautheret

愈伤组织培养基1943年White根培养基1925年Uspeaski和Uspenskaia海藻培养基1962年Mnjrashige&SkoogMS培养基改良培养基B5--十字花科(Gamborg等，1968)N6(朱自清等,1975,1987)&NitschH(Nitsch,1969)---禾本科植物花粉培养WS(Wolter&Skoog1966)&LS(Lingmal&skoog1962)---木本植物

第四十二页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日MS培养基30、40年代简单培养基无机盐浓度低，杂质高，培养效果差维生素氨基酸生长调节物质调节无机盐浓度（含有较高浓度的硝酸盐、铵盐、钾盐）胡萝卜黑樱桃MS基本培养基改良MS培养基

椰乳、水解酪蛋白、氨基酸等

增加各种无机盐浓度，尤其是N和K的浓度第四十三页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日糖的作用*在胡萝卜的细胞培养中，高浓度蔗糖下形成的胚状体较少，但其发育更接近于合子胚的情况。*在由烟草开花植株茎形成的愈伤组织及猪耳草茎、叶组织的再生中，葡萄糖促进花芽形成。*在某些试验中发现，在同一激素比例下，随糖浓度的不同，器官形成的类型也可能不同。第四十四页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日

含氮物质------维生素类物质和肌醇等维生素类物质：硫胺素---维生素B1

吡哆素---维生素B6

烟酸---维生素B3

泛酸钙---维生素B5

肌醇；水解酪蛋白（CH）；椰乳（CM）；玉米乳；麦芽提取液（ME）番茄汁（TJ）；酵母提取液（YE）2、氮**各种培养基中无机N都以两种形式供应：硝态氮和铵态氮配合使用，若单独应用硝态氮远优于铵态氮，因硝态氮的培养基易造成碱漂移，加入少量铵盐会抑制这种漂移。

第四十五页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日含氮物质作用*肌醇、腺嘌呤、酪蛋白水解物（CH）、酵母提取物（YE）和椰子汁等，对胚状体和芽的形成有良好的促进作用。*活性炭在花药培养中对提高诱导频率有良好作用，已发现在胡萝卜、洋葱等植物的体细胞培养中，加入活性炭也促进胚状体和器官的形成。第四十六页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日愈伤组织器官发生植株再生生长素、细胞分裂素、赤霉素等激素之间的互相平衡作用3生长激素A、生长素（用于细胞分裂和根的分化）常用生长素：IBA—吲哚丁酸；NOA—萘氧基乙酸

IAA—吲哚乙酸；2,4,5－T—2,4,5－三氯苯氧乙酸;NAA—萘乙酸；P－CPA---对氯苯氧基乙酸;2,4-D---2,4-二氯苯氧乙酸**NAA和IBA常与细胞分裂素结合用于芽的增长。**生长素可溶解在稀NaOH中或溶于乙酸。第四十七页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日B、细胞分裂素

常用的有：Kt---激动素

BAP---苄氨基嘌呤

2－iP---异戊烯腺嘌呤

**溶于稀酸或稀碱C、赤霉素：GA3，较生长素和细胞分裂素少用，可溶于水。

*有报道可以促进高粱形成的不定胚再生小植株的正常发育。

*注意激素的种类、浓度（绝对量）和配比对愈伤组织诱导、植株再生的作用。第四十八页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日二无机营养物质1氮和铁对某些组织胚状体形成的作用*胡萝卜细胞培养中发现培养基中的氮含量与胚状体形成密切有关。烟草花药培养中铁对胚状体的形成有良好促进作用。2无机盐浓度*在芽形成后，根的诱导形成通常降低培养基中无机盐的浓度并去除培养基中细胞激动素，或再加一种生长素(IAA、NAA、IBA)。通常采用White或1/2MS培养基。第四十九页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日**愈伤组织缺无机营养表现症状:（Heller,1965）N----某些愈伤组织出现花青甙，没有导管形成N、P或K----细胞过度增大且形成层减少S----愈伤组织非常明显褪绿Fe----细胞分裂停止B----细胞分裂和细胞伸长迟缓Mg和Mn----影响细胞伸长第五十页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日(4)琼脂

**琼脂并不是培养基必要的成分，对培养物起到支持作用。**使用浓度0.8-1.0%。**培养基类型:固体培养基和液体培养基。**培养基的pH值:

a通常为5.0-6.0

bpH<5.0培养基不能很好胶化，pH>6.0培养基硬度大。

c目前多采用pH=5.8。第五十一页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日MS基本培养基（mg/L）,pH=5.8

硝酸铵1650钼酸钠0.25硝酸钾1900硫酸铜0.025氯化钙440氯化钴0.025硫酸镁370硫酸亚铁27.8磷酸二氢钾170Na2EDTA37.3碘化钾0.83甘氨酸硼酸602肌醇100硫酸锰22.3蔗糖（％）3硫酸锌8.6第五十二页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日常用培养基的分类与特性根据目前常用培养基配方中含盐量多少可将培养基分为以下四大类。（一）含盐量较大的培养基较高浓度的硝酸盐、铵盐和钾盐，微量元素种类也很多MS培养基以及改良的MS培养基。LS（Linsmaier和Skoog，1965）、BL（Brown和Lawrence，1968）、ER（Eriksson，1965）。该类培养基有利于愈伤组织的诱导、生长和细胞培养。其中MS培养基在各类植物的组织、器官、细胞和原生质体培养中都取得很好的效果，是应用范围最广和适应性最强的培养基。第五十三页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（二）硝酸钾含量较高的培养基这类培养基盐浓度也很高，尤其是硝酸钾的含量较高，如B5（Gamborg等，1968）、N6（朱至清等，1975）、SH（Schenk和Hildebrandt，1972）。培养基中的和由NH4H2PO4提供。B5培养基含有较低的铵。实践证明，有些植物的愈伤组织和悬浮培养物在B5培养基上更适宜，比在MS培养基上生长得要好，尤其是那些对铵比较敏感的植物组织和细胞的离体培养效果更好。N6培养基中也含有较低浓度的铵离子，尤其是氨态氮和硝态氮的比例很合理，在禾谷类植物的花药、花粉和原生质体培养中得到广泛应用。第五十四页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（三）含盐量中等的培养基

这类培养基中大量元素为MS的1/2，微量元素种类减少，但含量增加，维生素种类比MS多，如H培养基（Bourgin和Nitsch，1979）。第五十五页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（四）低盐浓度的培养基这类培养基包括White培养基（1943）、WS（Wolter和Skoog，1966）和HE培养基（Heller，1953）等，其中White培养基由于无机盐的数量比较低，更适合木本植物的组织培养。

以上四类培养基中，前两类培养基比较适合愈伤组织诱导和细胞培养，但选用哪一类培养基，应依植物种类、基因型和外植体等而定；后两类培养基有利于根的形成。诱导愈伤组织常用的培养基为MS和B5。高盐浓度的培养基可能对培养过程中愈伤组织数量及鲜重的增加有利。

第五十六页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日**培养基选择与制备

1、培养基选择

2、培养基制备

A、逐一称取药品直接配成用于接种用的培养基。

B、先配成母液备用。第五十七页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日**促进组织和细胞培养中器官分化和胚状体的形成应注意以下几点：①降低或除去原来细胞增殖培养基中的生长素，这点在用2,4-D诱导细胞脱分化时更要注意；或用NAA、IAA代替2,4-D。但也要注意在某些情况中，低浓度的2,4-D对胚状体形成的促进作。②调整培养基中生长素/细胞激动素的比例，通常较高浓度的细胞激动素利于长芽，而较高浓度的生长素利于长根，但细胞激动素对胚状体的形成通常不利。③除了激素的比例外，也要注意所加激素的绝对量的响。第五十八页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日④要注意所用生长素和细胞激动素的种类，因为同类激素的不同化合物在不少情况下作用也不同。在某些情况下也可以考虑配合使用其它类激素如ABA、赤霉素等或生长抑制物质等⑤提高培养基中的氮含量及其它盐的浓度。⑥在不少情况下，还要注意顺序改变培养基的激素成分及其它营养物质。第五十九页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日第三节植物细胞及组织培养第六十页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日1、定义植物细胞培养：指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养。得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，而获得大量的细胞群体的一种技术。一、植物细胞培养第六十一页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日植物细胞培养的意义1．悬浮细胞大规模培养生产天然植物成分2．植物细胞培养可进行突变体筛选第六十二页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日植物细胞按照培养对象分类：单细胞培养单倍体培养原生质体培养第六十三页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日2、植物单细胞培养方法

(1)固体培养：是在微生物培养基基础上发展起来的植物细胞培养方法。一般添加一定比例的琼脂起固化作用。(2)固定化培养：属于固体培养，指将游离细胞包埋在多糖或多聚化合物制备的网状支持物中，培养液呈流动状态的无菌操作技术。第六十四页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日(3)液体培养：也是在微生物培养基础上发展起来的。可分为:

振荡培养旋转培养静止培养纸桥培养(4)细胞悬浮培养：属于液体培养，指植物细胞或小细胞团在液体培养基中大规模进行培养。第六十五页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日(5)分批培养：又称成比培养，指在一个固定容积的培养基中培养细胞，当培养基中主要的营养物质耗尽时生长就停止。(6)连续培养：在培养过程中由于不断注入新鲜培养基，故培养液中营养物质能够连续得到补充，培养物的容积一般是恒定的。第六十六页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日3、植物单细胞制备（1）获得植物单细胞三种途径由完整的植物器官分离单细胞的方法由培养组织中分离单细胞花粉叶肉组织是分离单细胞的最好材料。第六十七页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（2）．制备方法机械法：指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。优点：细胞不受酶伤害。缺点：只适合于排列松散的薄壁细胞、效率低、产量少。

1969年，Gnanam和Kulandaivelu用该方法分离出几种成熟叶片叶肉细胞。

第六十八页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日酶解法：指用专一的水解酶在温和条件下分解胞间层，分离细胞。优点：最有效的一种方法。缺点：成本较高，酶对细胞有一定伤害。

1968年，Takebe等用该方法分离烟草叶肉细胞成功。

第六十九页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日愈伤组织诱导法：指将愈伤组织反复继代，再转移至液体培养基振荡培养。添加生长素或酶。第七十页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日建立悬浮细胞培养系第七十一页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日4、单细胞培养方法举例

(1)．平板培养法指将一定量细胞接种到或混合到一薄层固体培养基里进行培养的方法。此法是Bergman(贝格曼，1960)首创。平板培养的优点是便于在显微镜下对细胞进行定点观察,选择单细胞株和筛选突变体。第七十二页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日平板培养法具体步骤：①单细胞悬浮液的制备，并记数。②调节细胞密度。③培养基选择与凝固剂选择，浇平板。④接种培养。第七十三页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日平板培养法第七十四页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（2）．看护培养与饲养层培养法看护培养：是指用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的培养方法。谬尔（Muir，1953）首创此法。该方法的优点是简便易行，效果好。但不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。第七十五页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日第七十六页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日饲养层培养：是用处理过的、无活性或分裂慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。饲养层培养具体方法有四种：①饲养细胞与靶细胞混合。②前者位于下层，后者相反。③一起培养于液体培养基中。④双层滤纸植板培养第七十七页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日第七十八页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（3）．液体浅层静置培养法

液体浅层静置培养法：指将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口静止培养。该方法优点：易于补加新鲜培养基，便于镜检。

第七十九页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（4）培养细胞生长的测定方法①细胞计数法：用血球计数板，以cells/ml表示。②细胞体积：将细胞离心于离心管内，测定细胞层所占体积。细胞密实体积（PCV）法③细胞鲜重或干重第八十页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（5）．微室培养是指在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。此法是DeRopp(戴洛普，1955)首创，Torry(托瑞，1957)、Jones(琼斯，1960)改进。优点是便于在显微镜下进行少量单细胞活体连续观察。

第八十一页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日第八十二页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日5、悬浮细胞培养的同步化方法（1）物理方法体积选择法：又称分级过筛法冷处理法（2）化学法饥饿法抑制法不连续密度梯度离心法第八十三页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日6、细胞的保存（1）．继代培养保存法悬浮培养的细胞每隔1～2周更换一次新鲜培养基继代培养。（2）．低温保存法一般选择5～10℃温度下培养，每隔10天更换一次培养液。（3）．冰冻保存低温保存超低温保存第八十四页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日7、植物细胞培养的应用（1）．与整株植物相比，细胞培养技术生产次生代谢物的优点如下：生产条件可控制。可选择优良的细胞系和优化的培养条件提高代谢物产量。节约土地、能源，生产不受季节限制。无菌培养，可减少病虫害。通过特定生物转化途径获得均一有效成分。探索新的合成途径，获得新的有用物质。第八十五页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（2）．细胞培养产品系列药用代谢物，包括苷类、甾醇类、生物碱、醌类、蛋白质类等。天然食品、食品添加剂，如色素、香料、甜味剂等。杀虫剂、杀菌剂。饲料、精细化工产品，

第八十六页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日

植物组织培养包括种子培养、胚培养、细胞培养、愈伤组织培养、芽培养、器官培养、原生质体培养和茎尖培养。二、植物组织培养的类型第八十七页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日1、种子培养

种子培养（Seedculture）是指在离体条件下通过种子获得苗或植株的培养。第八十八页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日2、胚培养

胚培养（Embryoculure）是指离体成熟胚或幼胚的培养。第八十九页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日3、器官培养

器官培养（Organculture）是指离体植物器官的培养，可以包括不同的类型，如茎尖（shoottip）、芽培养、根培养和花药培养。第九十页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日4、细胞培养

细胞培养（Cellculture）是指保持较好分散性的离体细胞或很小的细胞团的液体培养。第九十一页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日5、原生质体培养

原生质体培养（Protoplasmculture）是指利用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁而获得的完整的具有活力的原生质体的培养。第九十二页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日纯化的叶肉原生质体第九十三页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日第九十四页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（一）微型繁殖技术1）保持优良品种的遗传特性;2）高效快速地实现种苗的大量繁殖,在短时间中获得大量的优质种苗.第九十五页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（二）作物脱毒第九十六页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（三）人工种子第九十七页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日（四）单倍体育种第九十八页，共一百一十六页，编辑于2023年，星期日花药花粉细胞培养接种脱分化愈伤组织分化出小植物再分化单倍体植株移栽正常植株染色体加倍第九十九页，