分子生物学第二章DNA结构

第一节遗传物质的本质第二节核酸的化学组成第三节DNA的二级结构第四节DNA的物理化学性质第五节超螺旋和拓扑异构当前第1页\共有80页\编于星期五\17点第一节遗传物质的本质当前第2页\共有80页\编于星期五\17点

a、编码蛋白质和RNA的信息(编码tRNA、rRNA)

64个三联体密码子3个终止密码子编码氨基酸的61个密码子有简并性、通用性一、DNA携带两类不同的遗传信息当前第3页\共有80页\编于星期五\17点

b、编码基因选择性表达的信息基因选择性表达表现在：细胞周期的不同时相中个体发育不同阶段不同的器官和组织不同的外界环境下基因的表达与否以及量的差异当前第4页\共有80页\编于星期五\17点

*原核生物的结构基因占Genome的比例很大

Φx174phage5386bp结构基因用去5169bp比例达96％*真核生物的结构基因占Genome的比例很小

哺乳动物中结构基因只占10％～15％当前第5页\共有80页\编于星期五\17点其余80％以上的DNA起什么作用目前还无法精确解释，但可以肯定其中大部分DNA序列是编码基因选择性表达的遗传信息所以又称－－调控序列当前第6页\共有80页\编于星期五\17点二、RNA也可作为遗传物质

*RNA病毒传染媒介是病毒颗粒（病毒基因组RNA、蛋白质外壳）如:烟草花叶病毒（TobaccoMosaicVirus，TMV)

*类病毒（viroid）:使高等植物产生疾病的传染性因子分子结构：含246~375个核苷酸的单链环状RNA分子，没有蛋白质外壳。专性活细胞内寄生。当前第7页\共有80页\编于星期五\17点三、是否存在核酸以外的遗传物质

Prion(proteinaccousinfectionsparticle)朊病毒－－－蛋白质样的感染因子羊搔痒病(scripie)人类库鲁（kuru）病牛海绵状脑炎(疯牛病)…均由传染性病原蛋白颗粒引起统称Prion(朊病毒)

Prion复制?转录?翻译?

当前第8页\共有80页\编于星期五\17点疾病症状发病机理发现病例库鲁病（Kuru）共济失调、继发痴呆通过同类相食（人）传染约2600例医源性克雅氏病(iCJD）痴呆，共济失调通过朊病毒污染的HGH，或通过角膜移植约80例家族性克雅氏病同上PrP基因种系突变约100个家族零星发生克雅氏病同上体细胞突变PrPc自发转变为PrPsc？每年发生率约百万分之一克雅氏病新突变体vCJD共济失调，常伴有痴呆牛朊病毒传染？46例GS综合症（GSS）共济失调，常伴有痴呆PrP基因种系突变约50个家族致死性家族失眠症（FFI）睡眠隔离，接着失眠，痴呆PrP基因种系突变（D178N和M129）9个家族

人类朊病毒疾病、症状及发病机理

当前第9页\共有80页\编于星期五\17点致死性中枢神经系统的慢性退化病理表现：大脑皮层的神经原细胞退化、空泡变性、死亡、消失，最终被星状细胞取代，因而造成海棉状态当前第10页\共有80页\编于星期五\17点朊病毒带来了诺贝尔生理/医学奖1997

StanleyB.Prusiner发现朊病毒是作为老年性痴呆症等疾病的病原并能在寄主细胞中繁殖传播当前第11页\共有80页\编于星期五\17点第二节核酸的化学组成当前第12页\共有80页\编于星期五\17点嘧啶Pyrimidines嘌呤Purines一、碱基、核苷、核苷酸☉碱基NitrogenousbasesUracil(U)当前第13页\共有80页\编于星期五\17点☉核苷（nucleotide）糖苷键Glycosidicbond嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子核糖是戊糖RNA－核糖核苷DNA－脱氧核糖核苷当前第14页\共有80页\编于星期五\17点1’9☉核苷酸（nucleotideacid）核苷的磷酸酯脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸其中α和β、β和γ之间是高能磷酸键αβγdNTP当前第15页\共有80页\编于星期五\17点碱基＋戊糖＝核苷核苷＋磷酸＝核苷酸核糖核苷三磷酸缩写为NTP当前第16页\共有80页\编于星期五\17点二、DNA分子的一级结构(DNAsequence)1、多聚核苷酸链

主链是核糖和磷酸侧链为碱基由3’,5’磷酸二酯键连接2、链的方向：同一个磷酸基的3’酯键到5’酯键的方向(5’→3’)5’-UCAGGCUA-3’=UCAGGCUA

默认书写顺序5‘→3’3’5’当前第17页\共有80页\编于星期五\17点第二节DNA的二级结构当前第18页\共有80页\编于星期五\17点*1953.Watsosn&Crick

右手B-DNADoublehelixModel

一、DNA双螺旋模型的提出（doublehelixmodel）当前第19页\共有80页\编于星期五\17点每一单链具有5‘3’极性两条单链极性相反反向平行两条单链间以氢键连接以中心为轴，向右盘旋（直径2nm）双螺旋中存在大，小沟

*双螺旋的主链当前第20页\共有80页\编于星期五\17点磷酸二酯链(PhosphodiesterBackbone)当前第21页\共有80页\编于星期五\17点C-GT-A

碱基互补当前第22页\共有80页\编于星期五\17点·直径20Å

*双螺旋模型参数·螺距为34Å（任一条链绕轴一周所升降的距离）·每圈有10个核苷酸（碱基）·有大沟和小沟配对碱基并不充满双螺旋空间，且碱基对占据的空间不对称

·两个碱基之间的垂直距离是3.4Å。螺旋转角是36度当前第23页\共有80页\编于星期五\17点Pitch34ÅRise3.4ÅWidth20ÅMajorGrooveMinorGroove10.4bp/turn当前第24页\共有80页\编于星期五\17点Twist36°当前第25页\共有80页\编于星期五\17点◘大、小沟的差异⊕大沟中碱基差异容易识别，往往是蛋白质因子结合特异DAN序列的位点⊕小沟相对体现的信息较少当前第26页\共有80页\编于星期五\17点二、影响双螺旋结构稳定性的因素

l

氢键

(Hydrogenbond4~6kc/mol)

消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力

弱键,可加热解链氢键堆积,有序排列(线性,方向)

l

磷酸酯键(phosphoesterbond80~90kc/mol)l

0.2mol/LNa+

生理盐条件

强键,需酶促解链

*维持稳定性的因素当前第27页\共有80页\编于星期五\17点l

碱基堆积力(非特异性结合力)

(1kc/mol—0.6kc/mol)×n

☆范德华力（Vandewaalsforce）

(1.7A°/嘌呤环与嘧啶环作用半径)(0.34nm/碱基对间距)3.4A°当前第28页\共有80页\编于星期五\17点☆疏水作用力(Hydrophobicinteraction)

不溶于水的非极性分子在水中相互联合,成串结合的趋势力.(磷酸骨架,氨基,酮基周围水分子间的有序排列)l

磷酸基团间的静电斥力

碱基内能增加(温度),使氢键因碱基排列有序状态的破坏而减弱

*不稳定因素当前第29页\共有80页\编于星期五\17点三、双螺旋结构的基本形式

·B-DNA资料来自相对湿度为92％所得到的DNA钠盐纤维·此外人们还发现了A、C、D、E等右手双螺旋和左手双螺旋

Z构象等形式DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同一种双螺旋结构内参数存在差异的现象原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键当前第30页\共有80页\编于星期五\17点ABZHandednessBaseInclination当前第31页\共有80页\编于星期五\17点ABZ大沟宽小沟窄小沟窄大沟变深小沟宽浅大沟不存在小沟窄而深当前第32页\共有80页\编于星期五\17点1、反向重复序列与二级结构

反向重复序列（invertedrepeatitivesequenceorinvertedrepeatsIR）又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同时存在于一个分子中，但具有相反的方向有时也有不完全相同的情况RNA和DNA中都可能存在

此外还可有directedrepeatitivesequence---正向重复序列四、一些DNA序列的不寻常结构当前第33页\共有80页\编于星期五\17点C当前第34页\共有80页\编于星期五\17点反向重复序列间间隔较短或无间隔反向重复序列间间隔较长当前第35页\共有80页\编于星期五\17点

*较短的回文序列可能是作为一种信号

如：限制性内切酶的识别位点一些调控蛋白的识别位点

例如限制性内切酶EcoRⅠ的识别位点5‘－－GAATTC－－3’3‘－－CTTAAG－－5’当前第36页\共有80页\编于星期五\17点

（1）形成条件

一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核苷酸双链能够形成三链如：polyA/polyUpolydA/polydTpolyd(AG)/polyd(CT)2、三螺旋DNA(TribleHelixDNA,T.SDNA)可能与基因调控区域的功能和染色体重组有关当前第37页\共有80页\编于星期五\17点PolyT/A

TTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAA

PolyT/A

TTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAD.S.DNA+D.S.DNAT.S.

DNA+

S.S.

DNA（2）组成形式当前第38页\共有80页\编于星期五\17点

b、

分子组成

☆

PY/PU+PU(偏碱性介质中稳定)G＊G、A＊A、G＊A＋

☆PY/PU+PY(偏酸性介质中稳定)常见类型

G＊C＋A＊T第三条链位于B-DNA的Majorgroove中H-DNA两种异构体当前第39页\共有80页\编于星期五\17点

T.S.DNA的连接键

Watsonbonding

A＝TG≡C(D.S.DNA)H+Hoogsteen氢键G＝C+(质子化)(第三链,pH小于7)当前第40页\共有80页\编于星期五\17点三股螺旋DNA结构特点总结第三条单链DNA分子位于B-DNA大沟内与B-DNA以Hoogsteen键连接AT,GC两氢键配对，C必需质子化

poly(Py):(Pu):(Py)为常见类型TriblehelixMajorgroovePy:Pu:Py3ed*可能功能可能与基因调控区域的功能和染色体重组有关当前第41页\共有80页\编于星期五\17点3、四股螺旋DNA

(tetraplexDNA,TetrableHelixDNA)

均有形成四股螺旋DNA的可能

5’---TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’3’---AATCCCAATCCC-5’

Poly(G)染色体端粒高度重复的DNA序列形成条件－－串联重复的鸟苷酸已有实验结果表明－－真核细胞端粒中存在四链结构

当前第42页\共有80页\编于星期五\17点结构特点碱基之间靠Hoogsteen键连接GGGG基本结构单元－－鸟嘌呤四联体当前第43页\共有80页\编于星期五\17点可能的功能

A、稳定真核生物染色体结构

B、保证DNA末端准确复制

C、与DNA分子的组装有关

D、与染色体的meiosis&mitosis有关

HoogsteenBonding

5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT

3’-----AATCCCAATCCC

GGG

TA当前第44页\共有80页\编于星期五\17点当前第45页\共有80页\编于星期五\17点第四节DNA的物理、化学性质当前第46页\共有80页\编于星期五\17点

DNA双股链的互补是其结构和功能上的一个基本特征也是DNA研究中一些实验技术的基础当前第47页\共有80页\编于星期五\17点一、DNA分子的变性变性（denaturation或融解melting）：DNA双螺旋区的氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这一双链分离的过程叫做变性1、条件：加热,极端pH,有机溶剂（尿素、酰胺)，低盐浓度等

2、变性过程的表现

¤

是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很窄的温度范围¤导致一些理化性质发生剧烈变化当前第48页\共有80页\编于星期五\17点表现为：※熔液黏度降低※沉降速度加大※浮力密度上升※此外吸收值升高（A260nm），即增色效应指在DNA变性的过程中，他在260nm的吸收值先是缓慢上升，达到某一温度时及骤然上升天然DNA和变性DNA的吸收值相差可达34％D.SDNAA260=1.0S.SDNAA260=1.37dNTPsA260=1.60

当浓度为50μg/ml时：当前第49页\共有80页\编于星期五\17点1.1851.01.37OD℃

Tm

=OD增加值的中点温度(一般为85-95℃)或DNA双螺旋结构失去一半时的温度3、熔解曲线与融解温度(Tm值)

缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（现可做到0.1℃／分）可根据各点的A260值绘制成DNA的熔解曲线

这也是一般PCR实验技术中把变性温度定为94℃的原因当前第50页\共有80页\编于星期五\17点1、影响Tm值的因素

（1）在A,T,C,G随机分布的情况下，决定于GC含量（2）GC%含量相同的情况下GC%愈高→Tm值愈大GC%愈低→Tm值愈小

AT形成变性核心，变性加快，Tm值小碱基排列对Tm值具有明显影响5`GC3`CGn＞＞5`CG3`GCn5`TA3`ATn＜＜5`AT3`TAn36.7℃57.02℃

Tm136.12℃72.55℃

当前第51页\共有80页\编于星期五\17点

※

嘌呤嘧啶的排列顺序对双螺旋结构（稳定性）的影响

即－－氢键数目相同，但相邻碱基的堆积力不同

从嘌呤到嘧啶方向的碱基堆积力作用显著地大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基堆积作用Pyrimidine-PurineStepsHaveLittleBaseStacking5’3’3’5’CGAT5’CA3’3’GT5’当前第52页\共有80页\编于星期五\17点Purine-PyrimidineStepsHaveExtensiveBaseStacking5’3’3’CATG5’5’AC3’3’TG5’当前第53页\共有80页\编于星期五\17点生物体内仅UAA为最有效的终止密码子因为：UAAAUU的Tm值是最低的一个，即使生理温度下也不稳定当前第54页\共有80页\编于星期五\17点（3）大片段D.SDNA分子之间比较片段长短对Tm值的影响较小,与组成和排列相关（4）小于100bp的D.SDNA分子比较片段愈短，变性愈快，Tm值愈小（5）变性液中含有尿素，甲酰胺等尿素，甲酰胺与碱基间形成氢键改变碱基对间的氢键Tm值可降至40℃左右

（6）盐浓度的影响

每升0.18molNa+是常用的标准条件

思考题：室温下蒸馏水中的DNA会如何？当前第55页\共有80页\编于星期五\17点pH~12酮基→烯醇基pH~2-3NH2→NH2+(质子化)

改变氢键的形成与结合力（7）极端pH条件的影响一切减弱氢键，碱基堆积力的因素均将使Tm

值降低当前第56页\共有80页\编于星期五\17点2、常用的变性方法☆热变性☆碱变性应用广泛，特别是用于变性动力学研究缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链pH11.3时，全部氢键被淘汰无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法

◎保存单链DNA的条件

保持pH大于11.3盐浓度低于0.01mol/L当前第57页\共有80页\编于星期五\17点D.SDNAS.SDNADenaturation▲▼Renaturation复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞(DependsonthecollisionofcomplementaryS.S.DNA)

二、DNA分子的复性（annealorrenaturation）概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以重新地合成双螺旋结构的过程（退火）当前第58页\共有80页\编于星期五\17点

1、影响DNA复性过程的因素：

阳离子浓度0.18~0.2MNa+可消除polydNTP间的静电斥力复性反应的温度低于Tm值25℃左右(60-65℃)

S.S,DNA的初始浓度C0

DNA分子中,碱基的排列状况(随机排列,重复排列)

S.S.DNA分子的长度（片段的大小）S.S.DNA愈长S.S.DNA愈短→分子扩散愈慢→复性愈慢→分子扩散愈快→复性愈快当前第59页\共有80页\编于星期五\17点3’-ATCTATGCTGTCAT-5’5‘-TAGATACGACAGTA-3’5‘-TAGATACGACAGTA-3’3’-ATCTATGCTGTCAT-5’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’5‘-TATATATATATA-3’3’-ATATATATATAT-5’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’当前第60页\共有80页\编于星期五\17点二、C0t曲线－－复性发生过程的讨论dCt/dt=KC02

反应初始t=0单链DNA的随机碰撞过程（randomlycollision）单链DNA浓度=C0反应达t时单链DNA浓度=CtK＝复性速度常数包括两个因素：DNA的浓度（C，mol/L）和时间(s)当前第61页\共有80页\编于星期五\17点dCt/dt=KC02积分Ct/C0=1/(1+KC0t)当Ct/C0=1/2时Ct/C0=1/2=1/(1+KC0t(1/2))K=1/Cot(1/2)Cot(1/2)

=1/K(mol.Sec/L)常数

当前第62页\共有80页\编于星期五\17点Ct/C0是C0t的函数按此公式作图得C0t曲线Ct/C0

01C0t(1/2)C0t当前第63页\共有80页\编于星期五\17点基因组的复杂性＝单一序列的长度＋重复序列的长度复杂性的单位为核苷酸的数目例如：含单一序列a,b,c,d复杂性＝a+b+c+d复杂性＝分子量含106a,103b,10c,d复杂性＝a+b+c+d复杂性＜＜分子量基因组的复杂性(genomiccomplexity)当前第64页\共有80页\编于星期五\17点复杂性

*C0t和DNA的复杂性间存在线性关系：themorecomplexaDNA,thehigheritsCot(1/2)

1:10－62×105:0.42×109:4000当前第65页\共有80页\编于星期五\17点A"typical"mammalianC0tcurvehasthreeplateaus*C0t曲线能解释单一来源的DNA所具有的不同复杂性部分真核生物的基因组由高度重复（highlyrepetitive)序列、中度重复（moderatelyrepetitiveormid-repetitive)序列单一（singlecopy)序列组成当前第66页\共有80页\编于星期五\17点四、富含A－T序列和DNA双螺旋结构的呼吸作用●

高等生物染色体的某一区段，A·T含量变化很大

很多有重要调节功能的的DNA区段都富含A·T

（原核、真核－－复制起点、启动子、终止子等区域）●

DNA双螺旋结构的呼吸作用：DNA双螺旋结构内部，配对碱基的氢键的迅速断裂和再生的过程●

DNA内富含A·T区段呼吸作用尤为明显

这对于某些特殊的蛋白质与DNA发生反应并阅读链内部的信息具有重要作用当前第67页\共有80页\编于星期五\17点第五节超螺旋和拓扑异构当前第68页\共有80页\编于星期五\17点一、超螺旋（superhelixORsupercoil）●

最早在SV40和多瘤病毒中发现●超螺旋是所有线性或环形DNA的共有的重要特征ThesupercoilsoftheSV40minichromosomecanberelaxedtogenerateacircularstructure,whoselossofhistonesthengeneratessupercoilsinthefreeDNA.当前第69页\共有80页\编于星期五\17点1、超螺旋结构的方向性B-DNA紧缠overwinding(右旋)

正超螺旋（positivesupercoiled）导致左手超螺旋以一根绳子做实验：原来的绳子的两股以右旋方向缠绕；在绳子的一端向紧缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个左旋的超螺旋以解除外加捻转的协变当前第70页\共有80页\编于星期五\17点B-DNA松缠unwinding(左旋)

负超螺旋（NegativeSupercoiled）导致右手超螺旋在绳子的一端向松缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个右旋的超螺旋以解除外加捻转的协变当前第71页\共有80页\编于星期五\17点超螺旋的形成总是要向着抵消初级螺旋改变的方向发展所有生物的DNA几乎有5%为NegativeSuperhelix

二、超螺旋状态的描述1、可用数学公式描述Vinograd方程式L=T+W(α=β+γ)当前第72页\共有80页\编于星期五\17点L连接数（Linkingnumber）

双链DNA的交叉数，不发生链断裂时，L为定值T

盘绕数（Twistingnumber）双链DNA的缠绕数，初级螺旋圈数W超盘绕数（Writhingnumber）直观上为双螺旋在空间的转动数W=负值（negativesuperhelix）W=正值(positivesuperhelix）

当前第73页\共有80页\编于星期五\17点420bp*B-DNA是力学上稳定的结构(10bp/helix)*

螺旋数改变的结果之一是产生超螺旋

或是在B_DNA中保留一单链区域，但须能量的功给当前第74页\共有80页\编于星期五\17点

＊

DNA在水溶液中,构型偏B型状态＊

DNA以10.5bp/helix为最稳定构型＊

小于10.5bp/helix向正超螺旋发展(紧缩态)＊

大于10.5bp/helix向负超螺旋发展(松弛态)天然的DNA都是负超螺旋但一些生命活动过程中存在正超螺旋B-D