灭菌方法与生物指示剂

第一页，共四十页，编辑于2023年，星期日概要灭菌法和生物指示剂生物指示剂的形式无菌保证水平灭菌工艺验证常用灭菌方法制药工业常用的灭菌方法生物指示剂的使用孢子数测定

第二页，共四十页，编辑于2023年，星期日灭菌法和生物指示剂

灭菌法系指用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去，从而使物品残存活微生物的概率下降至预期的无菌保证水平的方法。

生物指示剂系一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一般是细菌的孢子。第三页，共四十页，编辑于2023年，星期日生物指示剂的形式一定数量的孢子附着在惰性载体上，如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品等孢子悬浮液密封于安瓿中

第四页，共四十页，编辑于2023年，星期日无菌保证水平

无菌保证水平一批物品的无菌特性只能相对地通过物品中活微生物的概率低至某个可接受水平来表述，即SAL（sterilityassurancelevel）。我国及欧美药典都把SAL不得大于百万分之一作为最终灭菌产品无菌保证的要求，即SAL≤10－6

第五页，共四十页，编辑于2023年，星期日灭菌工艺验证验证一个灭菌工艺系统能否使产品灭菌后达到无菌要求,通常认为灭菌后微生物残存概率小于1×10-6。物理性验证：通过得到的热分布与热穿透数据,来估测一个灭菌程序对微生物的致死性。化学指示剂验证：物品包外用化学指示剂用于验证物品是否经过灭菌处理，物品包内中心部位的化学指示剂才可作为物品是否达到灭菌的参考标志。生物指示剂验证：将已知其耐热性的生物指示剂直接接种在产品溶液或相似溶液中进行验证,是评判灭菌工艺杀灭效果最直观有效的方法,也是灭菌工艺验证必不可少的试验。第六页，共四十页，编辑于2023年，星期日常用的灭菌方法湿热灭菌法干热灭菌法气体灭菌法辐射灭菌法过滤除菌法第七页，共四十页，编辑于2023年，星期日不同灭菌方式不同的菌种种类的选择灭菌方法生物指示剂保藏号D值备注湿热灭菌法嗜热脂肪芽孢杆菌BacillusstearothermophilusNCTC10007NCIMB8157ATCC79531.5-3.0min生孢梭菌孢子ClostridiumsporogenesNCTC8594NCIMB8053ATCC79550.4-0.8min干热灭菌法枯草芽孢杆菌BacillussubtilisNCIMB8058ATCC9372>1.5min去热原验证时加大肠杆菌内毒素(Escherichiacoliendoxin)辐射灭菌法短小芽孢杆菌BacilluspumilusNCTC10327NCIMB10692ATCC271423kGy短小芽孢杆菌孢子可用于监控灭菌过程，但不能用于灭菌辐射剂量的建立气体灭菌法枯草芽孢杆菌BacillussubtilisNCTC10073ATCC9372>2.5min环氧乙烷灭菌嗜热脂肪芽孢杆菌BacillusstearothermophilusNCTC10007NCIMB8157ATCC795312980气态过氧化氢灭菌过滤除菌法缺陷假单胞菌PseudomonasdiminutaATCC19146用于滤膜孔径为0.22μm的滤器黏质沙雷菌Serratin

marcescensATCC14756用于滤膜孔径为0.45μm的滤器第八页，共四十页，编辑于2023年，星期日湿热灭菌法

指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。

须保证物品灭菌后的SAL≤10-6对热稳定的物品，可采用过度杀灭法，其SAL应≤10-12

第九页，共四十页，编辑于2023年，星期日适用范围

药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其它遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品第十页，共四十页，编辑于2023年，星期日常用的生物指示剂嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(SporesofBacillusstearothermophilus，NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953)D值为1.5～3.0min生孢梭菌孢子(SporesofClostridiumsporogenes，NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955

）

D值为0.4～0.8min第十一页，共四十页，编辑于2023年，星期日生物指示剂的选择第十二页，共四十页，编辑于2023年，星期日干热灭菌法

指物品于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中，利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。

保证灭菌后的产品其SAL≤10-6干热过度杀灭后产品的SAL应≤10-12

第十三页，共四十页，编辑于2023年，星期日

耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌的物品的灭菌，如玻璃器具、金属制容器、纤维制品、固体试药、液状石蜡等

适用范围第十四页，共四十页，编辑于2023年，星期日枯草芽孢杆菌孢子(SporesofBacillussubtilis，NCIMB8058、ATCC9372)

常用的生物指示剂

D值大于1.5min

第十五页，共四十页，编辑于2023年，星期日生物指示剂的选择第十六页，共四十页，编辑于2023年，星期日气体灭菌法

指用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法。在充有灭菌气体的高压腔室内进行。

常用气体：环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛等

第十七页，共四十页，编辑于2023年，星期日环氧乙烷法灭菌原理：强氧化，其分子作用于菌体后，能与菌体蛋白、核酸和酶中的—COOH、—NH2、—SH、—OH等基团起反应，而使菌体死亡。

具有杀菌谱广，灭菌能力强的特点，对微生物的繁殖体、芽孢有较强的杀灭效果。

第十八页，共四十页，编辑于2023年，星期日适用范围塑料包装的原料粉末、散剂、颗粒等固体药料及医疗器械类固体器具等不能采用高温灭菌的物品的灭菌含氯的物品及能吸附环氧乙烷的物品则不宜使用第十九页，共四十页，编辑于2023年，星期日常用生物指示剂枯草芽孢杆菌孢子(SporesofBacillussubtilis，NCTC10073、NCIMB8058、ATCC9372)

D值大于2.5min

第二十页，共四十页，编辑于2023年，星期日气态过氧化氢法是利用过氧化氢在低浓度的气体状态下比液体状态更具杀孢子能力的优点，经生成游离的-OH，用于进攻细胞成分，包括脂类、蛋白质和DNA，达到完全灭菌的要求的一种技术。第二十一页，共四十页，编辑于2023年，星期日应用：

隔离器的验证

新设备或灌装线的调整和认证大型或组装设备的评估未知气体分布动力学研究含有多个装载配置的设备认证设备中最难灭菌位置的日常检测

生物指示剂：嗜热脂肪芽胞杆菌孢子(SporesofBacillusstearothermophilus，NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953)第二十二页，共四十页，编辑于2023年，星期日生物指示剂的选择第二十三页，共四十页，编辑于2023年，星期日辐射灭菌法

应用γ射线、β射线杀灭细菌的方法，又称电离辐射，前者由钴-60或铯-137发出，穿透力强；后者由电子加速器产生，带电荷，穿透力弱，灭菌效果差。γ射线灭菌机理：γ射线直接作用于微生物的蛋白质、核酸和酶等，促使化学键断裂，杀死微生物；又可间接作用于微生物体内的水分子，引起水的电离和激发，生成自由基，再作用于微生物活性分子，使微生物死亡。对于辐射灭菌，无芽孢菌比有芽孢菌敏感得多；无芽孢菌中革兰氏阴性菌比阳性菌敏感；而病毒敏感性很差。

第二十四页，共四十页，编辑于2023年，星期日适用范围

不耐热药物的灭菌，医疗器械、容器、高分子材料、包装材料、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品等均可用本法灭菌。

第二十五页，共四十页，编辑于2023年，星期日常用生物指示剂

短小芽孢杆菌孢子(SporesofBacilluspumilus，如NCTC10327、NCIMB10692、ATCC27142)。置于放射剂量25kGy条件下，D值约3kGy。

第二十六页，共四十页，编辑于2023年，星期日过滤除菌法

系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。

适用范围：对热不稳定的药物溶液、气体、水或原料的除菌。

第二十七页，共四十页，编辑于2023年，星期日常用生物指示剂滤膜孔径为0.22μm的滤器：缺陷假单胞菌(Pseudomonasdiminuta,如ATCC19146)滤膜孔径为0.45μm的滤器：黏质沙雷菌(Serratin

marcescens,如ATCC14756)第二十八页，共四十页，编辑于2023年，星期日制药工业常用的灭菌方法原料药：化学合成药——较高熔点药物常用于干热灭菌法，对较低熔点的则用湿热灭菌法，对不耐热药物，如是晶体，可溶解后过滤除菌；

植物提取物——若是用常规或高温提取的单一成分的流浸膏，常用压力蒸汽法、流通蒸汽法消毒灭菌；若是低温提取物，则优先考虑过滤除菌；

生化药物——化学消毒灭菌剂，如低温乙醇法、低温间歇法和过滤法等。第二十九页，共四十页，编辑于2023年，星期日药品制剂：输液剂和水针剂——压力蒸汽灭菌法；热不稳定药物如冻干粉针剂——过滤法；多数药液——射线灭菌。软膏等半固体制剂：干热法或辐射法中药：大部份药材——压力蒸汽法；除含挥发油、对热不稳定成分的药材和生、熟功效不同的药材——热力法和辐射法。

第三十页，共四十页，编辑于2023年，星期日抗生素生产：培养基、种子罐和发酵罐——压力蒸汽法；无菌空气——过滤法；最终产品——过滤法。水和空气：过滤法、甲醛蒸气法。包装材料：玻璃材质的安瓿、西林瓶——干热法；聚乙烯、聚丙烯等塑料包装材料等——100℃蒸汽；橡胶塞等——湿热法。

第三十一页，共四十页，编辑于2023年，星期日厂房设施、设备和工器具：

不锈钢制密闭设备、管道——压力蒸汽；小的设备零部件、工器具和容器——干热法或湿热法；耐酸碱而不耐高温的塑料材质物品——过氧化氢法；洁净工作服、清洁工具——压力蒸汽法。第三十二页，共四十页，编辑于2023年，星期日常用灭菌方法汇总灭菌方法适用范围湿热法(压力蒸汽、流通蒸汽)设备、釜罐、管道、器械、耐热液体制剂、生药、无菌衣、清洁工器具等干热法(>170℃)某些设备、器械、耐热干粉粉剂、安瓿和西林瓶等包装容器射线法耐辐射药剂、生药、包装容器等环氧乙烷包装材料、器械、生药等过氧化物类(过氧化氢、二氧化氯)某些设备表面、工作台、器械、空气、水等醛类(甲醛、戊二醛)器械、工作台、包装台、空气过滤除菌法空气、水、不耐热液体药剂、生化药剂第三十三页，共四十页，编辑于2023年，星期日灭菌方法孢子生物指示剂产品蒸汽嗜热脂肪芽孢杆菌孢子、生孢梭菌孢子Smart-Read™EZTest®System（SEZS/5,SEZS/6）EZTest®(EZS/5,EZS/6)EZTestTestPack(STP)Releasat®(RS5/100,RS6/100)SGMStrip®(SGMS,SGMD)环氧乙烷枯草芽孢杆菌孢子EZTest®(EZG/6)EZTestTestPack(ETP)Releasat®(RG/100)SGMStrip®(SGMG,SGMD)低温甲醛蒸汽嗜热脂肪芽胞杆菌孢子SGMStrip®(SGMLF/6)第三十四页，共四十页，编辑于2023年，星期日灭菌方法孢子生物指示剂液体蒸汽嗜热脂肪芽孢杆菌孢子、枯草芽孢杆菌孢子SterilAmpII®(SA/4,SA/5,SA/6)SterilAmpII“5230”(SASU/6)MagnaAmp®(MA/5,MA/6)