灰树花多糖的提取及其水提物的抑菌论文

灰树花多糖的提取及其水提物的抑菌安徽工程大学毕业设计（论文）PAGEPAGEIIPAGEVPAGEV灰树花多糖的提取及其水提物的抑菌摘要近年来随着国家经济的发展及生活水平的提高，人们越来越关注绿色健康食品，而灰树花作为一种食、药兼用的菌类，具有很好的保健作用和很高的药用价值。灰树花其主要活性成份是灰树花蛋白多糖，多糖组份中以葡聚糖为主，以具有β-（1→6）分支的β-（1→3）葡聚糖为基本结构，含少量的木糖和甘露糖。研究结果表明，灰树花多糖主要通过增强细胞免疫功能而发挥其抗肿瘤作用，在基因水平上，本品有较强的抗化学诱变作用，可用于慢性乙型肝炎及恶性肿瘤放化疗后乏力、白细胞减少、免疫功能降低的综合治疗，并且对艾滋病的预防有一定作用。临床上灰树花多糖口服有效，安全无毒。灰树花多糖具有抗肿瘤、抗高血压、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎的药效。据美国一些癌症专门治疗医院临场实验表明，在化学治疗癌症的同时，用灰树花多糖抑制癌细胞比单纯化疗更见效果。日本医学专家用灰树花多糖进行抗肿瘤体内试验，结果表明，灰树花多糖抑制率可达86.5%，比国际认证的抗癌新药香菇多糖抑制率高出32%。实验中通过对温度、料液比、提取时间的单因素试验和正交试验得出提取灰树花多糖的最优条件，再通过灰树花水提物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌试验以及氯化汞、乙醇、新洁尔灭、青霉素的抑菌对照实验探究灰树花水提物的实际抑菌效果。结果显示，在温度80℃、料液比80:1、提取时间3h的单因子条件下提取率最高；在单因子试验的基础上对温度、料液比、提取时间进行正交试验，得到最优条件：80℃、60:1、1.5h，提取率达到7.94％。在灰树花水提物的抑菌效果实验中，得到对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为1:1，抑菌圈直径为8.74mm；大肠杆菌的最小抑菌浓度为1:1，抑菌圈直径为10.23mm；金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为1:8，抑菌圈直径为12.42mm。而在氯化汞（0.3%）、乙醇（75%）、新洁尔灭（1:2）、青霉素（1.6×105IU）的抑菌对照实验中对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径依次为：8.15mm、10.24mm、12.65mm、9.22mm、7.96mm、12.91mm、13.21mm、10.79mm、8.58mm、12.53mm、14.4mm、11.21mm近年来，灰树花作为一种高级保健食品，风行日本、新加坡等市场。经测定，灰树花中的多糖以β-葡聚糖(glucan)为主，其中抗癌活性最强，带6条支链的β-(1，3)-葡聚糖占相当大的比重，据说比已经面市的香菇多糖(Lentinan，日本的PSK,)、云芝多糖(上海的PSP)等有更强的抗癌能力。据专家评价，灰树花具有防癌、抗癌，抗衰老、促进性腺功能，防治糖尿病，抑制肥胖，双向调节血压，治疗动脉硬化和脑血栓等症，口服能美容和滋润皮肤、延缓老年斑出现，增加食欲、提高免疫力、增强记忆力等医疗保健功能。因此有“食用菌王子”之美称，是极具发展前景的高档食用菌。关键词：灰树花；多糖；提取率；抑菌效果PolysaccharideExtractionandbacteriostaticwaterextractAbstractInrecentyears,asthecountry'seconomicdevelopmentandtheimprovementoflivingstandards,peopleareincreasinglyconcernedaboutgreenandhealthyfood,andGrifolafrondosaasafood,medicineusedalongwithfungi,withgoodhealthcareandhighmedicinalvalue.ThemainactiveingredientisGrifolafrondosaproteoglycans,dextranpolysaccharidecomponentinordermainlytoaβ-(1→6)branchesoftheβ-(1→3)glucanasthebasicstructure,containingasmallamountofxyloseandmannose.Theresultsshowthatgrifolanprimarilybyenhancingimmunefunctionandexertitsanti-tumoreffect,atthegenelevel,theproducthasastrongresistancetochemicalmutagenesiscanbeusedforchronichepatitisBandaftercancerchemotherapyfatigue,leukopenia,decreasedimmunefunctionofcomprehensivetreatmentandpreventionofAIDShavearole.Clinicallygrifolanorallyactive,safeandnon-toxic.Polysaccharidewithanti-tumor,anti-highbloodpressure,lowerbloodsugar,anti-obesity,anti-hepatitisefficacy.AccordingtotheAmericanHospitalspecializesinthetreatmentofsomecancersspotexperimentsshowthatthechemicaltreatmentofcanceratthesametime,withtheinhibitionofcancercellgrifolanevenmoreeffectsthanchemotherapyalone.Japanesemedicalexpertswithinvivoantitumorgrifolantestresultsshowthattheinhibitionrategrifolanup86.5%,comparedwiththeinternationalcertificationofnewanticancerdrugsinhibittherateoflentinan32%.Throughexperiments,thetemperature,solid-liquidratio,extractiontime,singlefactorexperimentandorthogonalexperimenttoextractPolysaccharideoptimumconditions,andthroughthemaitakeextractonEscherichiacoli,Bacillussubtilis,StaphylococcusStaphylococcusbacteriatestsandmercuricchloride,ethanol,benzalkoniumbromide,penicillininhibitorycontrolexperimentstoexploretheactualwaterextractMaitakeantibacterialeffect.Theresultsshowthatatatemperatureof80℃,solid-liquidratioof80:1,theextractiontime3hundertheconditionsofasinglefactorhighestextractionrate;singlefactortestsbasedonthetemperature,thesolid-liquidratio,extractiontimeorthogonaltest,themostexcellentcondition:80℃,60:1,1.5h,theextractionratereached7.94percent.InMaitakeantibacterialeffectofaqueousextractexperiments,Bacillussubtilisgettheminimuminhibitoryconcentrationof1:1,inhibitionzonediameteris8.74mm;E.Theminimuminhibitoryconcentrationof1:1inhibitionzonediameterof10.23mm;Staphylococcusaureusminimuminhibitoryconcentrationof1:8,inhibitionzonediameterof12.42mm.Inmercuricchloride(0.3%),ethanol(75%),benzalkoniumbromide(1:2),penicillin(1.6×105IU)inhibitorycontrolexperimentsonBacillussubtilis,Escherichiacoli,Staphylococcusaureusbacteriadiametercirclewere:8.15mm,10.24mm,12.65mm,9.22mm,7.96mm,12.91mm,13.21mm,10.79mm,8.58mm,12.53mm,14.4mm,Inrecentyears,Grifolafrondosaasaseniorhealthfood,popularinJapan,Singaporeandothermarkets.Thedeterminationoffrondosapolysaccharidetoβ-glucan(glucan)-based,anti-canceractivityofwhichthestrongest,with6branchedβ-(1,3)-glucanaccountedforalargeproportion,issaidtohavebeenavailableformorethanlentinan(Lentinan,Japan,PSK,),PSK(Shanghai,PSP)andsohaveastrongerabilitytofightcancer.Accordingtoexpertassessment,Grifolafrondosahasanti-cancer,anti-cancer,anti-aging,promotegonadalfunction,diabetes,inhibitobesity,bidirectionalregulationofbloodpressure,treatmentofatherosclerosisandcerebralembolism,oraltobeautyandmoisturizetheskin,delayingtheappearanceofsenileplaques,increasedappetite,improveimmunity,enhancememoryandothermedicalcarefunctions.Therefore,the"mushroomprince"reputation,isverypromisinghigh-gradeedible.Keywords：Grifolafrondosa;polysaccharides;extractionrate;bacteriostaticeffect目录TOC\o"1-3"\h\u29355引言 -1-2077第1章材料与方法 -2-53321.1实验材料 -2-142611.2试验菌种 -2-90761.3实验药品与仪器 -2-147071.4实验方法 -3-132491.4.1葡萄糖标准曲线的测定 -3-54081.4.2灰树花多糖的提取单因素试验 -3-32681.4.3灰树花多糖的提取正交试验 -4-268361.4.4供试菌的活化及菌悬液的制备 -5-242881.4.5配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并倒平板 -5-157491.4.6灰树花水提物的抑菌效果实验 -5-124711.4.7氯化汞（0.3%）、乙醇（75%）、新洁尔灭（1:2）、青霉素（1.6×105IU）对各供试细菌的抑菌对照实验 -5-第63472章结果与分析 -6-72092.1葡萄糖标准曲线测定的结果 -6-89932.2灰树花多糖的提取单因素试验结果 -6-214912.2.1温度对灰树花多糖提取率的影响（40:1、2h） -6-14572.2.2料液比对灰树花多糖提取率的影响(60℃、2h) -7-199702.2.3时间对灰树花多糖提取率的影响（60℃、40:1） -8-267582.3灰树花多糖的提取正交试验 -8-190452.4灰树花水提物的抑菌效果实验 -9-224992.4.1灰树花水提物的最小抑菌浓度实验 -9-229862.4.2灰树花水提物的抑菌圈直径 -10-2891结论与展望 -12-10136致谢 -13-23831参考文献 -14-17043附录 -15-插图清单TOC\o"1-1"\h\u23840图2-1葡萄糖标准曲线 -7-32406图2-2温度对灰树花多糖提取率的影响（40:1、2h） -8-1198图2-3料液比对灰树花多糖提取率的影响(60℃、2h) -8-21097图2-4时间对灰树花多糖提取率的影响（60℃、40:1） -9-1607图2-5对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度 -10-1607图2-6对大肠杆菌的最小抑菌浓度 -10-23985图2-7对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度 -11-13452图2-8对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径 -11-30695图2-9对大肠杆菌的抑菌圈直径 -11-30695图2-10对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径 -11-表格清单TOC\o"1-1"\h\u32695表1-1实验药品 -2-5772表1-2实验仪器 -2-7638表1-3葡萄糖标准曲线的测定 -3-6369表1-4灰树花多糖提取正交试验表 -4-19315表1-5牛肉膏蛋白胨培养基配方表 -5-18990表1-6抑菌对照实验表 -5-31153表2-1葡萄糖标准曲线测定结果 -6-7757表2-2温度对灰树花多糖提取率的影响（40:1、2h） -6-4606表2-3料液比对灰树花多糖提取率的影响(60℃、2h) -7-15502表2-4时间对灰树花多糖提取率的影响（60℃、40:1） -8-28008表2-5灰树花多糖的提取三因素正交试验结果 -9-17641表2-6灰树花水提物抑菌效果实验结果 -10-19755表2-7对各供试细菌的抑菌对照实验结果 -11-PAGE16-17-17-引言灰树花在民间有悠久的药用历史。1709年日本贝原益轩的《大和本草》中记载了灰树花；1834年日本的本坂浩然的《菌谱》记载了灰树花的药用价值“味甘，平，无毒，可治痔。”我国中医认为灰树花具有“扶正固本”之功效。八十年代以来，以日本为主的许多国家对灰树花进行了大量的系统研究，已发表论文近200多篇[1]。综合近年日本、加拿大、意大利、英国等国家对灰树花药理作用的研究表明：灰树花具有抗癌和免疫增强作用，并具有抗高血压，降低血糖和血脂的作用和抗各类肝炎病毒的作用。灰树花其主要活性成份是灰树花蛋白多糖，多糖组份中以葡聚糖为主，以具有β-（1→6）分支的β-（1→3）葡聚糖为基本结构，含少量的木糖和甘露糖。研究结果表明，灰树花多糖主要通过增强细胞免疫功能而发挥其抗肿瘤作用，在基因水平上，本品有较强的抗化学诱变作用，可用于慢性乙型肝炎及恶性肿瘤放化疗后乏力、白细胞减少、免疫功能降低的综合治疗，并且对艾滋病的预防有一定作用[2]临床上灰树花多糖口服有效，安全无毒。灰树花多糖具有抗肿瘤、抗高血压、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎的药效。据美国一些癌症专门治疗医院临场实验表明，在化学治疗癌症的同时，用灰树花多糖抑制癌细胞比单纯化疗更见效果[3]。日本医学专家用灰树花多糖进行抗肿瘤体内试验，结果表明，灰树花多糖抑制率可达86.5%，比国际认证的抗癌新药香菇多糖抑制率高出32%。美国国家癌症研究院早在1992年就已证实，灰树花的萃取物有抵抗艾滋病病毒的功效。日本的南波宏明博士除在实验中发现灰树花具有抗HIV的作用外，还发现灰树花对乳腺癌、肺癌、肝癌也有疗效；还可改善肿瘤的化学疗法带来的种种不良反应，如缺乏食欲、呕吐、恶心、头发脱落以及白细胞减少等等；还可缓解疼痛。此外，研究还证实灰树花同时具有以下几种功效：(1)减少胰岛素抵抗，增强人体对胰岛素的敏感度，有助于控制血糖；(2)抑制脂肪细胞堆积；(3)降低血压；(4)增强免疫力[4]。最早进行灰树花人工栽培研究，是日本人伊藤一雄(1940年)和广江勇(1941年)，他们分别就灰树花特性孢子萌发，菌丝体生长所需的环境条件、树种与腐朽关系进行了系统研究。由于种种原因而被耽搁，直到20世纪70年代初期，灰树花才被重新认识，80年代初，日本开始人工栽培灰树花规模栽培，群马、福冈等地是主要栽培产区，日本庄司当著有《まいたけ自然栽培と施设》一书，大贯敬二在《图解家庭きのこの栽培法》中也有比较详细的栽培技术叙述。2007年，日本灰树花的产量仅次于香菇、金针菇、平菇、猴头菇等的大宗菇类[5]。我国对灰树花的研究起步较迟，1982年，三明真菌研究所黄年来等在福建黄岗山，采到野生子实体并分离得到菌种；1983年，浙江庆元县食用菌研究所韩省华等人从国外引种并培育出菇，20多年来，我国浙江、福建、上海、河北、四川、云南等地的一些科研单位，也相继进行了引种驯化和栽培试验研究。目前，浙江、河北、福建、山东、黑龙江、四川、北京、云南等地区都有了规模化生产[6]。第1章材料与方法1.1实验材料灰树花(Grifolafrondosa)由福建省古田县大丰工贸有限公司购买1.2试验菌种枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、大肠杆菌（Escherichiacoli）、金黄色葡萄球（Staphylococcusaureus），来自生物技术专业试验室1.3实验药品与仪器表1-1实验药品药品名称药品类型生产厂地葡萄糖分析纯AR国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠分析纯AR蚌埠化学试剂厂琼脂生化试剂BR国药集团化学试剂有限公司95％乙醇分析纯AR南京化学试剂一厂蒸馏水—实验室自制苯酚分析纯AR国药集团化学试剂有限公司浓硫酸分析纯AR国药集团化学试剂有限公司青霉素医用针剂华北制药股份有限公司表1-2实验仪器试验仪器仪器型号生产厂地电子天平CN0250上海民桥精密科技仪器有限公司数显生化培养箱250B金坛市杰瑞尔电器有限公司电热恒温鼓风干燥箱GZX-GF101-1-BS-Ⅱ上海贺德试验设备有限公司高速台式电动离心机TGL-16C金坛市杰瑞尔电器有限公司美菱电冰箱BCD—208ZM2D合肥美菱股份有限公司数显恒温水浴锅HH-2、HH-6金坛市杰瑞尔电器有限公司全自动电热压力蒸汽消毒器YM30上海三申医疗仪器有限公司自动三重纯水蒸馏器SZ-97上海本波仪器有限公司紫外分光光度仪723上海箐华科技仪器公司本实验其他实验用品有以下：粉碎机、抽滤机、打孔器、研钵、比色皿、大小烧杯、试管、接种针、接种环、玻璃棒、打火机、酒精灯、镊子、培养皿、量筒、尺子、锥形瓶、胶头滴管、移液管、离心管、涂布棒、旧报纸、绳子、滤纸、称量纸、棉花、签字笔、标签纸等。1.4实验方法1.4.1葡萄糖标准曲线的测定1、葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖50mg，蒸馏水定容至100mL得500ug/mL该溶液，再准确吸取5mL该溶液，蒸馏水定容至100mL，得25ug/mL的葡萄糖该溶液[7]。2、苯酚液的配置（现配）准确称取苯酚6g，蒸馏水加至100g，即得6%苯酚液，棕色瓶中避光保存。表1-3葡萄糖标准曲线的测定管号01234567葡萄糖/mL0.01.2苯酚液/mL1.01.01.01.01.01.01.01.0浓硫酸/mL5.05.05.05.05.05.05.05.0蒸馏水/mL2.00.8按表中参数加入到8支试管中，静止10min，摇匀放置20min。以0号作为空白调零，在最大吸收波长处（490mm）测定吸光度并记录，重复以上步骤，做三个平行组实验，算出各组平均值[8]。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线，用Excel软件求得回归方程[9]。1.4.2灰树花多糖的提取单因素试验1、温度对灰树花多糖提取率的影响（40:1、2h）取一定量的灰树花60℃烘干→粉碎机粉碎至粉末→配置成40:1液料比的提取液→分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的条件下恒温水浴浸提2h→抽滤得到灰树花多糖的提取液→稀释100倍后，用移液管取1mL的灰树花多糖稀释液到试管中→依次向试管中加入1.0mL蒸馏水、1.0mL6%苯酚液、5.0mL浓硫酸2、料液比对灰树花多糖提取率的影响（60℃、2h取一定量的灰树花60℃烘干→粉碎机粉碎至粉末→分别配置成10:1、25:1、40:1、60:1、80:1的液料比提取液→在60℃的条件下恒温水浴浸提2h→抽滤得到灰树花多糖的提取液→稀释100倍后，用移液管取1mL的灰树花多糖稀释液到试管中→依次向试管中加入1.0mL蒸馏水、1.0mL6%苯酚液、5.0mL浓硫酸→利用苯酚硫酸法测得反应后的溶液OD值→根据葡萄糖标准曲线读出OD值对应的多糖浓度→重复以上步骤，做三组平行实验算出其平均值[10]。3、提取时间对灰树花多糖提取率的影响（60℃、40:1取一定量的灰树花60℃烘干→粉碎机粉碎至粉末→配置成40:1的液料比提取液→在60℃的条件下分别恒温水浴浸提1h、1.5h、2h、2.5h、3h→抽滤得到灰树花多糖的提取液→稀释100倍后，用移液管取1mL的灰树花多糖稀释液到试管中→依次向试管中加入1.0mL蒸馏水、1.0mL6%苯酚液、5.0mL浓硫酸→利用苯酚硫酸法测得反应后的溶液OD值→根据葡萄糖标准曲线读出OD值对应的多糖浓度→重复以上步骤，做三组平行实验算出其平均值。1.4.3灰树花多糖的提取正交试验试管号温度料液比提取时间16025:11h27025:11.5h38025:12h46040:11.5h57040:12h68040:11h76060:12h87060:11h98060:11.5h根据单因素试验结果，灰树花多糖的提取率受到温度、料液比、提取时间的影响；为了进一步研究各因素对灰树花多糖提取率的影响，得出三个因素的的最优组合条件，设计出如下三因素的正交实验，根据正交结果进行极差分析和方差分析，得到最优培养条件。表1-4灰树花多糖提取正交试验表取一定量的灰树花60℃烘干→粉碎机粉碎至粉末→配置某一液料比提取液→在某一温度条件下恒温水浴浸提某一时间→抽滤得到灰树花多糖的提取液→稀释100倍后，用移液管取1mL的灰树花多糖稀释液到试管中→依次向试管中加入1.0mL蒸馏水、1.0mL6%苯酚液、5.0mL浓硫酸→利用苯酚硫酸法测得反应后的溶液OD值→根据葡萄糖标准曲线读出OD值对应的多糖浓度1.4.4供试菌的活化及菌悬液的制备挑选枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的供试菌置于斜面培养基,37℃活化24h，精挑菌苔于无菌水中制备成菌悬液备用[11]。1.4.5配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并倒平板按下表中的配方配置牛肉膏蛋白胨培养基，并倒平板。表1-5牛肉膏蛋白胨培养基配方表成分用量牛肉膏1.5g蛋白胨5gNaCl2.5g琼脂7.5~10g水500mLpH7.0~灰树花水提物的抑菌效果实验1、灰树花水提物对供试菌的最小抑菌浓度（MIC）的测定灰树花水提物溶液，用两倍法稀释水提物浓度，形成1:2、1:4、1:8等3个浓度梯度[12]。采用滤纸片法，即用100uL各供试菌悬液涂布于平板培养基，取浸泡于水提物溶液2h的直径6mm灭菌滤纸片置放于平板上，每平板放3片，细菌平板置37℃培养24h。观察各供试菌在不同浓度下的抑菌效果。2、灰树花水提物对细菌的抑菌效果采用1中相同的滤纸片法，测定1:1灰树花水提物对各供试细菌的抑菌效果。游标卡尺测量抑菌圈直径的大小，并拍照[13]。1.4.7氯化汞（0.3%）、乙醇（75%）、新洁尔灭（1:2）、青霉素（1.6×105IU）对各供试细菌的抑菌对照实验表1-6抑菌对照实验表对照试剂枯草芽孢杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌新洁尔灭（1:2）乙醇（75％）氯化汞（0.3％）青霉素（1.6×105IU）结果与分析2.1葡萄糖标准曲线测定的结果表2-1葡萄糖标准曲线测定结果浓度ug/mL1.252.557.51012.515OD值0.0420.1030.1360.2080.2450.3340.398回归方程：y=0.0264x+0.004r2=0.9990图2-1葡萄糖标准曲线根据所测出的葡萄糖标准曲线即可求得灰树花多糖提取液中的多糖浓度。2.2灰树花多糖的提取单因素试验结果2.2.1温度对灰树花多糖提取率的影响（40:1、2h）表2-2温度对灰树花多糖提取率的影响（40:1、2h）温度5060708090提取率3.33％4.53％5.97％7.65％6.92％图2-2温度对灰树花多糖提取率的影响（40:1、2h）由图中的曲线走势可知，不同温度条件下灰树花多糖的提取率有所不同，并且当温度小于80℃时，灰树花多糖的提取率随着温度的升高而增加，而当温度大于80℃时灰树花多糖的提取率有所下降。其原因是：在温度较低时，增加温度有利于多糖的浸提，而当温度高于2.2.2料液比对灰树花多糖提取率的影响(60℃、2h)表2-3料液比对灰树花多糖提取率的影响(60℃、2h)料液比10:125:140:160:180:1提取率2.97％3.27％4.78％5.16％5.33％图2-3料液比对灰树花多糖提取率的影响(60℃、2h)由图中的曲线走势可知，不同料液比条件下灰树花多糖的提取率有所不同，并且当料液比小于25:1时，灰树花多糖的提取率随着料液比的增大而缓慢增加，当料液比在25:1和40:1之间时灰树花多糖的提取率随着料液比的增大而增加较快，而当料液比大于40:1时，灰树花多糖的提取率随着料液比的增大又缓慢增加。其原因是：料液比过低和过高时，对灰树花多糖的提取影响较小，而在25:1和40:1区间内，随着料液比的提高，有利于多糖的浸提。2.2.3时间对灰树花多糖提取率的影响（60℃、40:1）表2-4时间对灰树花多糖提取率的影响（60℃、40:1）时间1h1.5h2h2.5h3h提取率3.52％4.29％4.63％4.78％4.84％图2-4时间对灰树花多糖提取率的影响（60℃、40:1）由图中的曲线走势可知，不同提取时间条件下灰树花多糖的提取率有所不同，并且在试验提取时间条件范围内，灰树花多糖的提取率随着提取时间的增加而逐渐增加，而当提取时间大于2h时，随着提取时间的增加，灰树花多糖的提取率增加很缓慢。其原因是，就整体趋势而言提取时间越久，多糖所得率越高，当过了2h后，多糖的增加量就很少了，对灰树花多糖的提取影响有限。2.3灰树花多糖的提取正交试验表2-5灰树花多糖的提取三因素正交试验结果试管号温度料液比提取时间多糖得率16025:11h3.06％27025:11.5h5.24％38025:12h7.21％46040:11.5h4.32％57040:12h5.96％68040:11h7.47％76060:12h5.03％87060:11h6.13％98060:11.5h7.87％=1\*ROMANI12.4115.5116.66—=2\*ROMANII17.3317.7517.43T=52.29％=3\*ROMANIII22.5519.0318.2μ=5.81％R3.381.170.51—通过灰树花多糖的提取三因素正交试验结果通过极差分析和方差分析可以得出，温度对灰树花多糖的提取影响达到极显著水平；影响灰树花多糖的提取率的因素大小顺序依次是：温度、料液比、提取时间。温度在试验范围内对灰树花多糖的提取影响相对较大，料液比在试验范围内对灰树花多糖的提取影响其次，而提取时间在试验范围内对灰树花多糖的提取影响相对较小。因此，由灰树花多糖的提取三因素正交试验可以确定灰树花多糖的提取最优条件为：温度80℃、料液比60:1、提取时间1.5h。最后，在最优条件下进行灰树花多糖的提取验证实验，三组平行实验中灰树花多糖的平均提取率达到7.94％，高于正交试验中的其他组灰树花多糖的提取率，得以验证。2.4灰树花水提物的抑菌效果实验2.4.1灰树花水提物的最小抑菌浓度实验图2-5对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度图2-6对大肠杆菌的最小抑菌浓度图2-7对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度2.4.2灰树花水提物的抑菌圈直径图2-8对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径图2-9对大肠杆菌的抑菌圈直径图2-10对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径表2-6灰树花水提物的抑菌效果实验结果菌种枯草芽孢杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度1:11:11:8抑菌圈直径8.74mm10.23mm12.42mm由灰树花水提物的抑菌效果实验结果图表可知，灰树花水提物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较明显，在1:8时即可对金黄色葡萄球菌的生长产生抑制效果，抑菌圈直径达到最大的12.42mm；而对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌作用只有在1:1时才会显现出来，抑菌圈直径分别为8.74mm、10.23mm，因此其对枯草芽孢杆菌的抑菌作用最弱。2.5氯化汞（0.3%）、乙醇（75%）、新洁尔灭（1:2）、青霉素（1.6×105IU）对各供试细菌的抑菌对照实验表2-7对各供试细菌的抑菌对照实验结果对照试剂枯草芽孢杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌新洁尔灭（1:2）12.65mm13.21mm14.4mm乙醇（75％）10.24mm12.91mm12.53mm氯化汞（0.3％）8.15mm7.96mm8.58mm青霉素（1.6×105IU）9.22mm10.79mm11.21mm通过对各供试细菌的抑菌对照实验可以得出，灰树花水提物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果大约介于氯化汞（0.3%）和青霉素（1.6×105IU）之间，对大肠杆菌的抑菌效果和青霉素（1.6×105IU）对大肠杆菌的抑菌效果接近，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果与乙醇（75%）对金黄色葡萄球菌的抑菌效果相当。结论与展望本试验主要研究灰树花多糖的提取及其水提物的抑菌，首先是通过温度、料液比、提取时间的单因素试验和正交试验得出提取灰树花多糖的最优条件，再通过灰树花水提物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌试验以及氯化汞、乙醇、新洁尔灭、青霉素的抑菌对照实验探究灰树花水提物的实际抑菌效果。实验结果得出，灰树花多糖的提取单因素试验中在温度80℃、料液比80:1、提取时间3h的单因子条件下提取率最高；在单因子试验的基础上对灰树花多糖的提取进行温度、料液比、提取时间的正交试验，得到最优条件：80℃、60:1、1.5h，提取率达到7.94％。在灰树花水提物的抑菌效果实验中，得出对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为1:1，抑菌圈直径为8.74mm；大肠杆菌的最小抑菌浓度为1:1，抑菌圈直径为10.23mm；金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为1:8，抑菌圈直径为12.42mm。而在氯化汞（0.3%）、乙醇（75%）、新洁尔灭（1:2）、青霉素（1.6×105IU）的抑菌对照实验中对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径依次为：8.15mm、10.24mm、12.65mm、9.22mm、7.96mm、12.91mm、13.21mm、10.79mm、8.58mm、12.53mm、14.4mm、11.21mm。灰树花是一种很大的蘑菇，其多生长于远东的深山之中，以及北美和欧洲。灰树花也被称为“舞菇”，因其美味和有益健康而闻名。历史上，灰树花被作为滋补剂和适应原使用。其被作为帮助提升良好状态和活力的食物。传统上，食用该类蘑菇被认为可预防高血压和癌症等，并已成为现代医学研究的焦点[14]。灰树花其主要活性成份是灰树花蛋白多糖，多糖组份中以葡聚糖为主，以具有β-（1→6）分支的β-（1→3）葡聚糖为基本结构，含少量的木糖和甘露糖。研究结果表明，灰树花多糖主要通过增强细胞免疫功能而发挥其抗肿瘤作用，在基因水平上，本品有较强的抗化学诱变作用，可用于慢性乙型肝炎及恶性肿瘤放化疗后乏力、白细胞减少、免疫功能降低的综合治疗，并且对艾滋病的预防有一定作用。临床上灰树花多糖口服有效，安全无毒[4]。灰树花多糖具有抗肿瘤、抗高血压、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎的药效。据美国一些癌症专门治疗医院临场实验表明，在化学治疗癌症的同时，用灰树花多糖抑制癌细胞比单纯化疗更见效果。日本医学专家用灰树花多糖进行抗肿瘤体内试验，结果表明，灰树花多糖抑制率可达86.5%，比国际认证的抗癌新药香菇多糖抑制率高出32%。有人认为葡聚糖的β—1→3结构方式可能是动物、植物及所有宿主防御机制的基本诱发因子，既可以使无脊椎动物抗拒真菌感染，也可使植物免遭病毒与真菌病害。而所有微生物的细胞壁都有β—1→3葡聚糖结构，因而具有广谱免疫调节作用，因此灰树花葡聚糖不单在医药方面，在农业方面也有广阔的应用前景[15]。致谢本次毕业设计经过几个多月来的努力，从实验选题到查找资料，从反复试验到写稿修改，以至如今的最终成稿，都离不开老师和同学们的帮助。首先诚挚的感谢我的毕业设计指导老师柴瑞娟老师，由于她还带着大二、大三、大四三个年级的课程，平时的教学工作比较忙碌，在忙碌中仍然挤出宝贵的时间来指导我的毕业设计，从最初的选题查资料、实验过程中遇到的种种问题以及最后最后的论文撰写都给予了我极大的帮助。还有教过我的所有教研组中的老师们，你们在我平时的学习生活中教会了我很多有用的知识，对我今后的人生道路都有着很大的帮助。另外还要感谢生物技术专业的所有同学，除了在毕业设计中给予我的帮助，还有在一起生活、学习的四年中，让我收获颇丰，值得一辈子去怀念。最后我要感谢安徽工程大学和生物化学工程学院给我的人生旅程中留下了美好的大学时光，谢谢你们。孙晨201参考文献[1]刘振伟,史秀娟.灰树花的研究开发现状[J].食用菌,2001,（4）：5-6.[2]王增池.灰树花的生态条件与药用价值[J].中国食用菌,1998,17（6）：39-40.[3]卢兆双,王光远,赵晨,等.灰树花胞内粗多糖提取条件的优化及其提取物的抑瘤作用[J].食用菌学报,2009,16（1）：51-54.[4]裘娟萍,孙培龙,朱家荣,等.灰树花深层发酵培养基的研究[J].微生物学通报,2000,27（4）：275-278.[5]苏颖,周选围.改进苯酚硫酸法快速测定虫草多糖含量[J].食品研究与开发,2008,29(3):118-121.[6]刑增涛,周昌艳,潘迎捷,等.灰树花多糖研究进展[J].食用菌学报,1999,6（3）：54-58.[7]徐吉民.正交法在医药科研中的应用[M].中国医药科技出版社,1987.[8]李磊,王卫国,郭家瑞,等.几株灰树花菌株液态发酵产多糖性能的比较[J].河南工业大学学报,2010,31（2）:71-75.[9]杨勇杰,姜瑞芝,陈英红,等.苯酚一硫酸法测定杂糖含量的研究[J].中成药,2005,27(6):706-708.[10]宋玉良,陈建真.灰树花中多糖含量的测定[J].浙江中医学院学报,2000,24(06):67.[11]汪维云,王继先.灰树花液体发酵及多糖提取工艺的优化研究[J].农业工程学报,2007,23(04):276-279.[12]郑亚凤,谢宝贵,徐培雄,等.正交法优化三种灰树花多糖提取工艺[J].食用菌,2008(05):55-57.[13]杨阳,刘承初,贾薇,等.灰树花多糖的超滤分离及免疫活性研究[J].食品科学,2008,29(09):277-280.[14]InYoungBae,HwaYeonKim,SuyongLee,HyeonGyuLee.EffectofthedegreeofoxidationonthephysicochemicalandbiologicalpropertiesGrifolafrondosapolysaccharides[J].CarbohydratePolymers,2011,83:1298–1302.[15]Matsui,K.,Kodama,N.,&Nanba,H.EffectsofMaitake(Grifolafrondosa)D-fractiononthecarcinomaangiogenesis[J].CancerLetters,2001,172:193–198.附录葡萄糖标准曲线测定平行实验平行组1.252.557.51012.51510.0370.0970.1250.2110.2440.3390.38820.046