食品酶学多酚氧化酶演示文稿

食品酶学多酚氧化酶演示文稿当前第1页\共有44页\编于星期四\14点食品酶学多酚氧化酶当前第2页\共有44页\编于星期四\14点一、多酚氧化酶的名称和自然界的分布多酚氧化酶(1,2-苯二酚:氧氧化还原酶,EC1.10.3.1)

一类含铜的氧化还原酶，催化邻-苯二酚氧化成邻-苯二醌，也能作用于单酚单加氧酶的底物。1、多酚氧化酶的名称当前第3页\共有44页\编于星期四\14点多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catecholoxidse,EC.1.10.3.2)漆酶(对苯二酚氧化酶laccase,EC.1.10.3.1)。当前第4页\共有44页\编于星期四\14点现在所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。当前第5页\共有44页\编于星期四\14点2、植物中多酚氧化酶分布多酚氧化酶是植物中最受注意的一种酶,在葡萄,无花果,枣,茶叶和咖啡豆、可可豆中含量很高,它在这些果实中起着有益的作用，甚至是形成产品特征性的香气和色泽所必需的。当前第6页\共有44页\编于星期四\14点红茶发酵（生成茶红素）、可可粉、葡萄干、梅干、椰枣、无花果。红茶是全发酵茶，茶中的多酚物质主要是儿茶素经多酚氧化酶与过氧化物酶的作用，氧化并聚合生成茶黄素和茶红素。当前第7页\共有44页\编于星期四\14点多酚氧化酶在桃,苹果,香蕉,荔枝,马铃薯,莲藕和莴苣中的含量也是相当高,然而它对这些果实起着不好的作用,易引起褐变,造成变质和腐烂,对于果蔬贮存及加工过程中的品质有重要影响。当前第8页\共有44页\编于星期四\14点热带水果50%以上的损失都是由于酶促褐变引起的.同时酶促褐变也是造成新鲜蔬菜例如莴苣和果汁的颜色变化,营养和口感变劣的主要原因控制果蔬加工和贮藏过程中酶促褐变。当前第9页\共有44页\编于星期四\14点多酚氧化酶在植物中的含量随品种不同而有很大变化，在众多的水果和蔬菜中，橄榄中的多酚氧化酶活力最高。多酚氧化酶的活力分布还取决于果蔬的成熟度。在植物叶片中，很大一部分酶活力集中在叶绿体中，在马铃薯块茎中，几乎集中在亚细胞部分中；在新采收的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。当前第10页\共有44页\编于星期四\14点果蔬中不同的部位的多酚氧化酶含量差别很大，例如葡萄皮中的酶活力比果肉中高。茶叶中的多酚氧化酶分为游离态和结合态，前者主要存在于细胞液中，属可溶态多酚氧化酶；后者主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态。当前第11页\共有44页\编于星期四\14点二、多酚氧化酶催化反应及其作用底物1.催化反应多酚氧化酶可以催化两种不同类型的反应：（1）一元酚羟基化，生产相应的邻二羟基化合物当前第12页\共有44页\编于星期四\14点（2）邻二酚氧化，生成邻醌类物质。反应机制：氧首先与酶结合，然后邻二酚与酶结合，接着氢从酚转移到Cu2+形成氢过氧化络合物，此结合物再同第二个邻二酚结合，反应中没有自由基中间物形成。两种反应都需要有分子氧的参与。当前第13页\共有44页\编于星期四\14点多酚氧化酶蛋白包含两部分：催化氧化与羟基化羟基化活力容易损失（与小分子辅助因子有关）酶活力对来源不同的酶有很大差异当前第14页\共有44页\编于星期四\14点

多酚氧化酶催化的氧化反应的最初产物邻位醌将继续变化。①相互作用生成高分子量聚合物。②与氨基酸或蛋白质作用生成高分子复合物。③氧化那些氧化还原电位较低的化合物。其中①②导致黑色素的生成，反应③的产物是无色的。酶促褐变当前第15页\共有44页\编于星期四\14点2.作用底物水果、蔬菜中底物为：一元酚类邻二酚类（对位二酚也可）（间位二酚不作底物）如：

水果中的儿茶酚

OH

OH

土豆中的酪氨酸

HOCH2CHCOOHNH2

当前第16页\共有44页\编于星期四\14点重要的天然底物当前第17页\共有44页\编于星期四\14点影响多酚氧化酶作用的因素一元酚和二元酚取代基的位置较高的底物专一性底物的相对专一性因来源不同而变化当前第18页\共有44页\编于星期四\14点三、pH和温度对多酚氧化酶活力影响1.pH对酶活力的影响（1）pH的改变影响酶分子侧链上有关基团的解离状态，这些基团的解离状态与酶的专一性及酶分子活力中心的构象有关，从而影响到酶活性中心的高级结构。（2）pH的改变影响底物分子中某些基团的解离状态，也可能影响到中间产物ES的解离状态，影响到ES的形成，从而降低酶活性。当前第19页\共有44页\编于星期四\14点多酚氧化酶的最适pH(1)最适pH：4～7(2)不同种类，不同品种的果蔬甚至果蔬的不同部位得到的多酚氧化酶的最适pH也存在差异(3)酶的提取或分离的方法对它的最适pH也有影响(4)测定酶活力时所采用的底物和缓冲液对酶的最适pH也有影响(5大多数多酚氧化酶只有一个最适pH,在一些情况下,有第二个最适pH最适pH因酶的来源和底物的不同存在较大的差异。当前第20页\共有44页\编于星期四\14点2.温度对多酚氧化酶活力影响不同种类、品种、部位的多酚氧化酶有不同的热稳定性，通常最适温度在常温加热易使酶失活同一来源的多酚氧化酶的不同分子形式具有不同的热稳定性低温下多酚氧化酶的活力也有明显的下降，但活性下降比较缓慢当前第21页\共有44页\编于星期四\14点四、多酚氧化酶的激活剂、抑制剂和果蔬酶促褐变的防止1.激活剂植物中存在的多酚氧化酶在天然状态下一般以非活性形式存在。可以通过高盐处理、机械损伤、酸碱刺激或在尿素、表面活性剂、蛋白酶以及胰酶的作用下活化。激活机制主要包括：增溶作用、同工酶的互变和分子修饰作用，以及酶-抑制剂复合物的分离和蛋白酶的水解等使酶构象发生变化。当前第22页\共有44页\编于星期四\14点2.抑制剂和果蔬酶促褐变的防止多酚氧化酶活性的抑制方式：化学抑制：硫脲、EDTA、巯基乙醇、亚硫酸钠、柠檬酸、抗坏血酸、4-羟基苯甲酸酯等。物理控制：改变贮藏环境的气体成分、热处理、高压灭菌、辐射、超声处理等。分子生物学方法：利用转基因技术阻碍多酚氧化酶的表达、使用反义RNA技术降低多酚氧化酶活性等。当前第23页\共有44页\编于星期四\14点酶促褐变:较浅色的水果、蔬菜在受到机械性损伤（削皮、切片、压伤、虫咬、磨浆、捣碎）及处于异常环境变化（受冻、受热等），在酶促催化下氧化而呈褐色，称为酶促褐变。西瓜、香瓜、桔子、柠檬无酚酶，不褐变。当前第24页\共有44页\编于星期四\14点实例1：土豆的褐变当前第25页\共有44页\编于星期四\14点实例2：含有儿茶酚水果的褐变当前第26页\共有44页\编于星期四\14点褐变防止方法酶促褐变的三个条件，缺一不可。即：多酚类物质、多酚氧化酶、氧气除去多酚类物质困难，不现实。∴一般为降低多酚氧化酶活性、驱氧

当前第27页\共有44页\编于星期四\14点(1)加热钝化酶活性75～95℃、5～7S的加热处理，可使大部分酶活性丧失。常用的方法有：漂烫、巴氏杀菌

加工中，必须严格控制时间和温度。加热温度过高，加热时间过长，可抑制酶褐变，但会影响食品品质；加热不足，不能抑制酶褐变。微波加热，热穿透力强，迅速均匀，不影响风味。当前第28页\共有44页\编于星期四\14点(2)螯合酶促作用的金属离子多酚氧化酶是以铜作为辅基的金属蛋白。金属（铁、锡、铝等）离子是多酚氧化酶的激活剂。柠檬酸对Cu2+有螯合作用。EDTA是一种金属离子螯合剂，可阻止金属离子对褐变反应的促进作用，但其与作用对象有关，有的效果则不明显。当前第29页\共有44页\编于星期四\14点(3)酸处理法多数酚酶最适pH＝6～7，pH<3失活(高酸性环境会使酶蛋白上的铜离子解离下来，导致多酚氧化酶逐渐失活，酶活性趋于最低。)常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血酸、混合酸。当前第30页\共有44页\编于星期四\14点柠檬酸可降低pH，还可络合酚酶辅基Cu2+，但单独用效果不大。常与抗坏血酸、亚硫酸合用。实践证明：0.5%柠檬酸+0.3%抗坏血酸效果好。抗坏血酸不但能降低体系pH，而且具有还原剂的作用，可将体系中的醌类及其衍生物还原成酚，并通过自身氧化来减少体系的含氧量。当前第31页\共有44页\编于星期四\14点抗坏血酸抑制酶褐变的机理（图）当前第32页\共有44页\编于星期四\14点（4）酶活抑制剂亚硫酸类是最常用的多酚氧化酶抑制剂。常用的有：二氧化硫、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、低亚硫酸钠(Na2S2O4)如：在蘑菇、马铃薯、桃、苹果等加工中，常用二氧化硫及亚硫酸盐类作护色剂。防止褐变的原因有三：a.抑制多酚氧化酶活性b.将醌还原为酚c.与醌反应生成无色加成产物当前第33页\共有44页\编于星期四\14点(5)驱氧通过沸水烫漂、抽真空（93kPa，5～15min）、高浓度抗坏血酸溶液浸泡、气调包装设计等均可达到驱除食品内氧气的目的，从而抑制酶褐变的发生。控制氧气含量用抽空处理技术或添加去氧剂等方法：用2%食盐+0.2%柠檬酸+0.06%偏重亚硫酸钠溶液作抽空液，在500mmHg的真空度抽真空5～10min,可取得良好的护色效果。

当前第34页\共有44页\编于星期四\14点五、多酚氧化酶的分子形式多酚氧化酶有多种分子形式原因：①类似的亚基不同程度的聚合；②不同亚基不同方式的结合;③酶蛋白质构象的改变;④前三种情况的结合。多酚氧化酶多种分子形式之间的差别表现在底物特异性、最适pH、温度稳定性、对抑制剂敏感性、氧化和羟基化活力的差别。当前第35页\共有44页\编于星期四\14点六、多酚氧化酶活力测定多酚氧化酶的提取方法：丙酮粉法匀浆法匀浆浸提法当前第36页\共有44页\编于星期四\14点多酚氧化酶的测定方法：（1）检压法：在一定温度、pH和基质浓度下，多酚氧化酶氧化基质的速度与单位时间内的耗氧量成正比。用瓦氏呼吸计测定耗氧率。（2）氧电极法：利用氧电极测定反应中的耗氧量来表示酶活力当前第37页\共有44页\编于星期四\14点（3）分光光度法：多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化成有色产物，单位时间内有色产物在460nm处的吸光度与酶活强弱成正比。（4）碘量滴定法分光光度法操作简单，结果准确，最为常用。当前第38页\共有44页\编于星期四\14点七、水果和蔬菜中的多酚氧化酶及其底物正常条件下，在未受损水果中，酚类物质是与多酚氧化酶存在于不同部位。这种分布是通过一系列膜系统实现的，受膜屏障的作用，这种区域性的分布阻止了底物和酶的相互接触，所以正常组织是不发生褐变的，一旦膜系统受损，使物质的区域化分布破坏，多酚氧化酶与酚类物质接近并与其发生化学作用，这将导致褐变。当前第39页\共有44页\编于星期四\14点1.苹果中多酚氧化酶多酚氧化酶是引起苹果褐变的重要原因之一在苹果生长过程中，总酚含量逐渐下降，至成熟期稳定，酶活力变化趋势与总酚类似。未成熟的苹果比成熟的更易褐变在大多数情况下，酶促褐变倾向在保藏期间是增加的。机械损伤可引起酶促褐变，但褐变的速率起初较高，随后下降到零。